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1、5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一種非蛋白質(zhì)類(lèi)五碳氨基酸,是葉綠素和亞血紅素和維生素B12等吡咯物質(zhì)生物合成中重要的前體物質(zhì)。ALA具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域,ALA可以作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、除草劑和殺蟲(chóng)劑。在醫(yī)藥領(lǐng)域,ALA可以作為光動(dòng)力學(xué)診斷劑和治療藥物應(yīng)用于腫瘤和皮膚癌治療。因此,ALA研究?jī)r(jià)值越來(lái)越多的受到研究者的重視,其具有寬闊的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。
目前,工業(yè)上ALA的生產(chǎn)主要以化學(xué)合成為主,但是化學(xué)合
2、成存在步驟繁多、副產(chǎn)物多、得率低和污染環(huán)境等缺點(diǎn)。越來(lái)越多的研究者專(zhuān)注于利用微生物合成ALA,ALA微生物的合成以C4途徑為主,但在該反應(yīng)中需要添加甘氨酸和琥珀酸等底物,生產(chǎn)成本比較高,不適合大規(guī)模工業(yè)化地生產(chǎn)ALA。因此本實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)以C5途徑生產(chǎn)ALA的大腸桿菌工程菌,通過(guò)過(guò)表達(dá)編ALA C5途徑兩個(gè)限速酶基因(編碼谷氨酰-tRNA還原酶的hemA基因和編碼谷氨酰-1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶hemL基因),以及改造ALA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),成功構(gòu)建了能
3、夠利用廉價(jià)的葡萄糖作為唯一的碳源合成ALA的重組大腸桿菌(DALA)。但是該重組大腸桿菌產(chǎn)ALA的最高產(chǎn)量只有4g/L左右,產(chǎn)量較低;且含有重組質(zhì)粒,導(dǎo)致菌株發(fā)酵不穩(wěn)定,因此,需要進(jìn)一步探索優(yōu)化其發(fā)酵條件以降低生產(chǎn)成本和提高ALA產(chǎn)量,同時(shí)構(gòu)建產(chǎn)ALA高穩(wěn)定性菌株。
本論文首先在實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的利用C5途徑產(chǎn)ALA的的大腸桿菌重組菌株(DALA:E.coil DH5α/pUC19-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA
4、)的基礎(chǔ)上嘗試使用工業(yè)發(fā)酵常用的廉價(jià)的pH調(diào)節(jié)劑碳酸鈣替代實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的pH調(diào)節(jié)劑NaOH來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程的pH和通過(guò)在ALA發(fā)酵培養(yǎng)基中添加胰蛋白胨豐富培養(yǎng)基的成分來(lái)獲得更高的ALA產(chǎn)量。然而通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加碳酸鈣和胰蛋白胨能夠影響ALA的積累。本文研究重點(diǎn)是對(duì)重組大腸桿菌(DALA)在發(fā)酵罐培養(yǎng)中相關(guān)的發(fā)酵條件,例如發(fā)酵溫度、pH、溶氧、接種量和N源補(bǔ)加等條件進(jìn)行優(yōu)化,確定重組大腸桿菌(DALA)發(fā)酵罐最佳的培養(yǎng)條件,在5L發(fā)酵罐發(fā)
5、酵實(shí)驗(yàn)中,重組大腸桿菌(DALA)在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定前期轉(zhuǎn)速為400rpm/min,通氣量為1.5 vvm,穩(wěn)定期轉(zhuǎn)速為200 rpm,0.5 vvm,發(fā)酵后期溶氧降為0%,使重組大腸桿菌處于微好氧狀態(tài);整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程溫度為37℃;發(fā)酵pH在菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定前期時(shí)為6.5,當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí),pH調(diào)為6.0。通過(guò)優(yōu)化后發(fā)酵條件進(jìn)行5L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得ALA的最高產(chǎn)量達(dá)到5.3 g/L,比實(shí)驗(yàn)室先期發(fā)酵條件優(yōu)化的5L發(fā)酵罐發(fā)酵ALA的產(chǎn)
6、量提高了1.3倍左右。然后嘗試將發(fā)酵液中的ALA經(jīng)過(guò)一系列粗分離提純步驟,首先將發(fā)酵液中的ALA酸化,以提高ALA的穩(wěn)定性,高速離心和膜處理除去菌體等雜質(zhì),反滲透膜除水,活性炭脫色,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,冷凍干燥,獲取ALA粗制品。
發(fā)酵生產(chǎn)菌株含有質(zhì)粒不穩(wěn)定,易丟失,常常造成產(chǎn)物在生產(chǎn)過(guò)程中不穩(wěn)定。本文通過(guò)利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的FLP/FRT位點(diǎn)專(zhuān)一性重組法,將產(chǎn)ALA的C5途徑中兩個(gè)關(guān)鍵的基因hemAM-hemL隨機(jī)整合到敲除arcA和
7、recA基因的DH5α宿主菌中,通過(guò)檢測(cè)拷貝數(shù),獲得高拷貝不依賴質(zhì)粒的穩(wěn)定地產(chǎn)ALA工業(yè)生產(chǎn)菌株。經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)獲得整合最高6個(gè)基因拷貝穩(wěn)定生產(chǎn)菌株,并對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵獲得ALA的最高產(chǎn)量能達(dá)到0.6 g/L。
綜上所述,本論文在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)構(gòu)建的產(chǎn)ALA的重組菌株(DALA)的基礎(chǔ)上,通過(guò)多種手段優(yōu)化發(fā)酵條件,提高ALA的產(chǎn)量,也對(duì)ALA進(jìn)行初步的粗分離提取,為實(shí)驗(yàn)室以后ALA生產(chǎn)的發(fā)酵條件和下游分離提純提供指導(dǎo)。通過(guò)FLP/
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