利用人工鋅指蛋白技術(shù)提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產(chǎn)量.pdf

1、石油資源儲量不斷減少，而且石油基燃料和化學品大量使用產(chǎn)生的環(huán)境污染及氣候變化等問題日益突出，嚴重影響經(jīng)濟和社會的可持續(xù)發(fā)展。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源豐富且可再生，特別是各類農(nóng)林廢棄物，其主要成分半纖維素和纖維素可以水解為糖，進而通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料和生物基化學品。這一生物煉制技術(shù)路線，可望替代石油依賴型經(jīng)濟，已經(jīng)得到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。半纖維素易于水解，但纖維素作為植物細胞壁的主要成分提供保護作用，自然進化使其對水解有強抗性，特別是對

2、酶的作用。因此，高效低成本纖維素酶成為建立基于纖維素水解的糖平臺，乃至生物煉制的瓶頸之一。纖維素酶是復合酶系，主要由纖維二糖水解酶、內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等組成，高效降解木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)需要多種酶組分的協(xié)同作用。來自絲狀真菌里氏木霉的Trichoderma reesei Rut-C30是纖維素酶高產(chǎn)菌株之一，已廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)，但纖維素酶發(fā)酵過程酶產(chǎn)量低導致成本高的問題特別突出，無法用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源的生物煉制。T.r

3、eesei纖維素酶合成調(diào)控機制研究表明，纖維素酶的生物合成主要由Xyr1、Cre1等內(nèi)源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控，但其他影響因素還有待進一步闡明。鋅指蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu)，是多種生命體系中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，利用人工設計的鋅指蛋白文庫進行改造并選育突變體，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，已廣泛應用于大腸桿菌和酵母等微生物，并成功獲得了耐溫性等表型或外源蛋白過量表達的突變體，但是目前為止還未見其應用在絲狀真菌中的報道。本研究工作首次探討了人工鋅指蛋白(Artifici

4、al Zinc Finger Protein，AZFP)對里氏木霉纖維素酶生產(chǎn)的影響，利用AZFP文庫轉(zhuǎn)化T.reeseiRut-C30，篩選高產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌突變體，并與對照菌株比較，研究突變體纖維素酶組分和蛋白分泌情況。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴構(gòu)建了適用于絲狀真菌的表達載體，比較了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化方法，并對根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化方法進行了條件優(yōu)化，確定最佳轉(zhuǎn)化條件為:根癌農(nóng)桿菌AGL-1生長OD660值達到

5、0.8時，在pH5.3、24℃及乙酰丁香酮濃度200μM條件下進行轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化效率可達到200個轉(zhuǎn)化子/106孢子。進而，構(gòu)建絲狀真菌人工鋅指蛋白表達載體文庫并轉(zhuǎn)化T.reesei Rut-C30，獲得了近600個轉(zhuǎn)化子，通過纖維素平板培養(yǎng)和搖瓶液體發(fā)酵篩選，獲得了高產(chǎn)纖維素酶的T.reeseiRut-C30轉(zhuǎn)化子(U3)。⑵對U3進行性能驗證，發(fā)現(xiàn)其纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了55％，通過RNA定量分析和纖維素酶組分酶學性質(zhì)測定，

6、確定U3菌株的β葡萄糖苷酶活性比出發(fā)菌株提高了8倍，同時內(nèi)切葡聚糖酶活性提高了28％。利用粗酶液對堿預處理玉米秸稈進行水解，其葡萄糖收率比出發(fā)菌株T.reesei Rut-C30粗酶液水解過程提高了115％。這些結(jié)果表明:U3菌株纖維素酶酶系的組成在其人工鋅指蛋白AZFP-U3的作用下發(fā)生了顯著變化，從而提高了纖維素組分的酶解效率。對AZFP-U3潛在的靶點基因進行分析，結(jié)合實時定量PCR的驗證結(jié)果，進一步選擇并對四個可能的靶基因進行功

7、能驗證，分別編碼兩個功能未知假定的轉(zhuǎn)錄因子（TrireC30_125610和TrireC30_7183）、線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白(TrireC30_46633)和糖苷水解酶(TrireC30_88814)基因。構(gòu)建表達載體，將上述基因在T.reesei Rut-C30中過量表達，檢測其對纖維素酶生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子125610的過表達使Rut-C30胞外纖維素酶酶活提高了200％，同時轉(zhuǎn)化子T125610胞外蛋白分泌能力提高了219％。

8、⑶通過人工鋅指蛋白文庫篩選得到的另外一個轉(zhuǎn)化子U5比U3具有更強的纖維素降解能力，其胞外分泌的纖維素酶活性比出發(fā)菌株提高了112％，同時檢測到其胞外蛋白分泌量提高了大約86％。比較U5和出發(fā)菌株發(fā)酵獲得的粗酶液對堿預處理后的玉米秸稈進行酶解效果，發(fā)現(xiàn)其葡萄糖收率提高了33.9％。主要纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄分析和各組分酶活測定都表明U5纖維素酶各組分酶活發(fā)生顯著變化，對U5和出發(fā)菌株進行比較轉(zhuǎn)錄組學分析，進一步揭示人工鋅指蛋白提高纖維素酶合成的

9、分子機理。⑷轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果表明:培養(yǎng)24 h時，U5突變株糖苷水解酶、轉(zhuǎn)運蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及蛋白酶體，參與mRNA監(jiān)測途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工途徑的基因，轉(zhuǎn)錄水平比出發(fā)菌株有顯著提高，而且過氧化物酶體、CoA合成途徑、N-糖苷合成途徑、氨酰-tRNA合成途徑、煙酰胺代謝途徑、脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平也有上調(diào)，為纖維素酶轉(zhuǎn)錄和蛋白修飾加工過程中提供氨基酸前體、輔酶和能量。此外，U5中絲狀真菌蛋白分泌壓力響機制（RESS）受到激活，在48

10、 h時尤為明顯，RESS的激活可使過多的mRNA迅速降解，盡管RESS與纖維素酶合成的關(guān)系還有待深入研究，此時突變體U5中主要糖苷水解酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄量與出發(fā)菌株相比仍然顯著上調(diào)，表明AZFP-U5對糖苷水解酶轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾具有促進作用。AZFP-U5潛在的靶點基因轉(zhuǎn)錄分析也發(fā)現(xiàn)變化，這些基因包括負責蛋白翻譯后修飾、信號傳遞、氨基酸代謝的基因。比較轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)分析結(jié)果，為進一步探討人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子在T.reesei中