25223.利用木聚糖產(chǎn)生乙醇的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建

1、Fyj?！磳W(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：1、堅(jiān)持以搿求實(shí)、創(chuàng)新“的科學(xué)精神從事研究工作。2、本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果。3、本論文中除引文外，所有實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)和有關(guān)材料均是真實(shí)的。4、本論文中除引文和致謝的內(nèi)容外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。5、其他同志對(duì)本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了聲明并表示了謝意。研究生簽名：邀盛日期：2壁乜ff：五學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解南京師范大

2、學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門或其指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版；有權(quán)將學(xué)位論文用于非贏利目的的少量復(fù)制并允許論文進(jìn)入學(xué)校圖書館被查閱；有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索：有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。m研究生簽名：選盛日期：邊2幺叢：五產(chǎn)成本偏高，在一定程度上限制了燃料乙醇工業(yè)的發(fā)展。充分利用植物纖維素中的所有組分，是生產(chǎn)纖維素乙醇的一個(gè)關(guān)鍵因素。

3、常用的釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌發(fā)酵只能利用葡萄糖，而不能利用植物纖維素類中的其它組分。到目前為止，自然界中尚未發(fā)現(xiàn)哪種微生物可以有效的利用植物纖維素代謝產(chǎn)生乙醇。本研究的主要目的就是構(gòu)建能夠利用木聚糖產(chǎn)乙醇的基因工程菌株，為半纖維素類生物質(zhì)的利用打下基礎(chǔ)。1Escherichiacoli作為模式微生物，發(fā)酵產(chǎn)乙醇途徑和分子基礎(chǔ)研究非常清楚。但是由于野生型的Ecoli缺少高活力的乙醇產(chǎn)生酶，厭氧發(fā)酵時(shí)的主要產(chǎn)物是各種有機(jī)酸，乙醇含量非常低

4、。為了提高Ecoli代謝產(chǎn)乙醇能力，將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌產(chǎn)乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因丙酮酸脫羧酶基因(pdc)和乙醇脫氫酶基因(adhB)整合到Ecoli的染色體上。首先克隆運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌來(lái)源的pdc和adhB基因，比較其自身啟動(dòng)子和Ecoli來(lái)源的啟動(dòng)子對(duì)pdc和adhB的表達(dá)效果。分別構(gòu)建pdc和adhB基因的整合載體，利用kRed同源重組技術(shù)將pdc和adhB依次整合到Ecoli染色體上的glmS基因位點(diǎn)處。試驗(yàn)結(jié)果表明，在厭氧條件下

5、，該基因工程菌產(chǎn)乙醇能力有顯著提高，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵20h后，基因工程菌株可產(chǎn)乙醇05grL。為減少乙醇發(fā)酵中副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，通過對(duì)大腸桿菌的糖酵解以及碳代謝流向的分析，敲除大腸桿菌乳酸脫氫酶，以期減少有機(jī)酸的產(chǎn)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，在厭氧條件下，突變株生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，并且在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)不到乳酸的積累。2Ecoli不具備木聚糖降解酶，為構(gòu)建能夠利用木聚糖的基因工程菌，需引入木聚糖降解酶系中的關(guān)鍵酶一木聚糖酶。Bacillus