納米DBM作為支架表面修飾材料及骨移植替代物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、臨床上多種骨科疾患需要骨移植替代物行植骨融合和骨結(jié)構(gòu)修復(fù)重建，如創(chuàng)傷、腫瘤、骨折不愈合、骨組織發(fā)育不良、脊柱融合手術(shù)等等。骨結(jié)構(gòu)修復(fù)重建是改善骨缺損患者日常生活質(zhì)量、使其重新投入社會(huì)勞動(dòng)的唯一有效方法，因此骨替代物的研究對(duì)社會(huì)發(fā)展具有極其重要的意義，也是骨組織工程的終極目標(biāo)。
　　目前已有數(shù)十種復(fù)合骨移植替代產(chǎn)品獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療，這些產(chǎn)品雖然具有良好的生物相容性，能一定程度上誘導(dǎo)成骨分化，但難以同時(shí)滿足與宿主骨組織相匹

2、配的機(jī)械性能和供成骨細(xì)胞滲透生長(zhǎng)的合理三維孔隙結(jié)構(gòu)，尤其在治療大段骨缺損時(shí)，現(xiàn)有的骨移植替代物產(chǎn)品難以達(dá)到臨床骨組織重建要求。鑒于天然骨組織特殊的生理微觀結(jié)構(gòu)，理想的骨替代產(chǎn)品應(yīng)具備以下條件:(1)與宿主骨組織相匹配的機(jī)械強(qiáng)度;(2)恰當(dāng)?shù)目紫堵屎涂紫督Y(jié)構(gòu);(3)利于細(xì)胞粘附、分化和增殖的表面結(jié)構(gòu);(4)良好的生物相容性以及與骨組織生長(zhǎng)相適應(yīng)的可控降解率。由此可見(jiàn)，當(dāng)前的眾多產(chǎn)品還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想骨替代物的標(biāo)準(zhǔn)。如何改進(jìn)骨替代原材料模擬構(gòu)

3、建骨組織結(jié)構(gòu)技術(shù)，顯得尤為重要。
　　近年來(lái)，3D打印技術(shù)用于骨缺損的修復(fù)重建已成為一種新的熱點(diǎn)及趨勢(shì)，但單純的3D打印支架成骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)性能均欠佳，支架表面需要用一些具有骨誘導(dǎo)或成骨作用生物活性材料做修飾，才能改善其性能。目前用于表面修飾的材料主要是生物活性玻璃，生物陶瓷及納米羥基磷灰石等，但上述材料成分均為無(wú)機(jī)物，且成骨誘導(dǎo)性能較差，表面修飾物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)雖然能改善支架成骨誘導(dǎo)功能，但其確實(shí)效果有待進(jìn)一

4、步實(shí)驗(yàn)考證。
　　脫鈣骨基質(zhì)(DBM)主要由93％的膠原（傳導(dǎo)成骨表面活性物質(zhì)）、5％的可溶性蛋白（誘導(dǎo)成骨的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等協(xié)同蛋白）以及2％的殘余礦化基質(zhì)，是具有良好的誘導(dǎo)成骨、傳導(dǎo)成骨特性的商業(yè)化生物材料。它以單獨(dú)或聯(lián)合其他材料的方式廣泛用于骨折、骨不連、骨腫瘤、骨融合、股骨頭壞死等手術(shù)。但是DBM缺少骨礦物質(zhì)，因機(jī)械強(qiáng)度較差而難以成為理想的骨移植替代物。但若將DBM經(jīng)過(guò)一定的物理方法進(jìn)行顆粒

5、尺度上的改變，而后作為3D打印支架的表面修飾，這有可能使支架在獲得穩(wěn)定機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，增加支架的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)能力。
　　將材料納米化并應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)成為近年來(lái)骨組織工程的研究熱點(diǎn)。其研究方向主要集中于礦化機(jī)理、改善支架骨誘導(dǎo)性能、組織修復(fù)、藥物載體、細(xì)胞載體及基因載體等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這一領(lǐng)域已取得了良好的進(jìn)展。但眾多骨移植材料中鮮有關(guān)于納米同種（異體）脫鈣骨基質(zhì)(nDBM)的研究報(bào)道。納米材料具有特殊的比表面

6、積效應(yīng)，它極易與外來(lái)原子吸附鍵結(jié)合，表現(xiàn)的特性不同于它在整體狀態(tài)時(shí)的性質(zhì)。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞對(duì)納米尺度材料極其敏感，在60-150nm時(shí)尤為明顯，納米顆粒及粗糙的納米凹槽結(jié)構(gòu)可有效增加絲狀偽足的感知能力，促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散及粘附，使其在納米纖維構(gòu)成的三維微環(huán)境快速增殖。
　　為此，本課首先通過(guò)改良Urist法制備凍干脫鈣骨基質(zhì)，運(yùn)用二次低溫物理研磨法將DBM研磨至納米級(jí)別，電鏡檢測(cè)其粒徑尺度并對(duì)其生物安全性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)

7、。隨后將實(shí)驗(yàn)組前期制備的PCL-TCP3D打印支架進(jìn)行nDBM表面修飾，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物骨缺損模型填充等實(shí)驗(yàn)，對(duì)其生物相容性及體內(nèi)骨缺損修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)以上努力，發(fā)展具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高生物安全性骨修復(fù)用生物材料的制備新方法，并為該種新型骨組織工程支架的進(jìn)一步的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分:nDBM的制備及性能檢測(cè)
　　目的:旨在通過(guò)物理研磨法將塊狀DBM處理至納米級(jí)，并對(duì)研磨效果及材料的生物安全性進(jìn)行

8、檢測(cè)
　　方法:采用低溫研磨法，先將DBM初步研磨至微米級(jí)別顆粒，再通過(guò)高能球磨機(jī)進(jìn)行納米尺度研磨，掃描電鏡觀測(cè)研磨效果及材料形貌。而后按醫(yī)用生物植入材料安全標(biāo)準(zhǔn)ISO10993(GB/T16886)對(duì)nDBM行急性毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、致敏試驗(yàn)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)材料的生物安全性。
　　結(jié)果:經(jīng)二次低溫物理研磨后，所制得的nDBM底層致密，呈纖維狀相互連接，纖維粗細(xì)不等，直徑約40-80nm，表面充滿不規(guī)則納米顆粒，顆粒直徑

9、20nm-50nm左右，納米顆粒相互團(tuán)聚，表面密布納米級(jí)別凹槽，納米纖維結(jié)構(gòu)間相互連接，內(nèi)部形成大量相互連通的微米級(jí)別孔隙，其微觀結(jié)構(gòu)符合納米生物材料范疇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，nDBM不引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性毒性反應(yīng)，溶血率復(fù)合生物材料安全性要求，無(wú)致敏現(xiàn)象發(fā)生，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖良好。因此，nDBM具有良好的生物相容性，可用于體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)論:低溫物理研磨法能成功將DBM納米化，材料的生物安全性指標(biāo)符合醫(yī)用植入材料安全標(biāo)準(zhǔn)。<

10、br>　　第二部分:nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架的構(gòu)建及生物學(xué)性能檢測(cè)
　　目的:將nDBM修飾于PCL-TCP3D打印支架表面，并對(duì)各組材料的生物相容性及成骨誘導(dǎo)性進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法:采用浸泡凍干法將nDBM均勻負(fù)載于支架表面，通過(guò)掃描電鏡觀察復(fù)合支架構(gòu)建效果，而后進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，CCK-8法檢驗(yàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況，實(shí)時(shí)熒光PCR、Westen bolt檢測(cè)材料成骨誘導(dǎo)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，并對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)

11、行分析。
　　結(jié)果:采用75％的乙醇作為溶劑，按nDBM與稀釋劑1∶5的比例浸泡后的支架，經(jīng)凍干后，可使支架各纖維表面均勻覆蓋nDBM顆粒，電鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn)，nDBM與支架粘附良好，底層致密，表面布滿大小不一的nDBM顆粒，納米顆粒部分團(tuán)聚，表面布滿納米級(jí)別凹槽，成功構(gòu)建了一種新型的nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架。通過(guò)CCK-8檢測(cè)BMSCs的增殖情況，通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在nDBM修飾的支架表面不斷增殖，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞

12、增長(zhǎng)數(shù)量均高于單純PCL-TPC支架。Western blot、real-time PCR等多種實(shí)驗(yàn)表明nDBM修飾的復(fù)合支架各成骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平明顯高于單純支架組。
　　結(jié)論:采用凍干法能成功制備具有納米級(jí)別表面結(jié)構(gòu)的nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架。CCK-8、Western blot、real-time PCR等多種實(shí)驗(yàn)表明nDBM修飾的復(fù)合支架有利于BMSCs增殖并向成骨細(xì)胞方向分化。
　　第三部分:nDBM

13、對(duì)兔股骨和nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架對(duì)兔橈骨大段骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:評(píng)價(jià)nDBM對(duì)兔股骨缺損及nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架對(duì)兔橈骨大段骨缺損的修復(fù)能力。
　　方法:建立兔股骨缺損模型，將nDBM填充入缺損部位并設(shè)立空白對(duì)照組;建立兔橈骨大段骨缺損模型，將nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架植入缺損部位，對(duì)照組植入單純PCL-TCP支架。術(shù)后一定的時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取材，通過(guò)大體觀察，Micro CT及組織切片染

14、色等評(píng)價(jià)材料骨缺損修復(fù)情況。
　　結(jié)果:大體觀察見(jiàn)nDBM填充組骨缺損區(qū)皮質(zhì)已基本愈合;nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架組骨缺損兩端已有骨痂形成。影像學(xué)檢查提示nDBM組骨修復(fù)效果優(yōu)于空白組;nDBM/PCL-TCP復(fù)合支架組骨痂明顯生成，部分支架纖維表面甚至已形成骨橋，優(yōu)于單純PCL-TCP支架。組織切片染色顯示nDBM修飾的復(fù)合支架孔隙內(nèi)大量骨細(xì)胞長(zhǎng)入、纖維形成，部分支架表面甚至形成板層骨，骨誘導(dǎo)及成骨性能均優(yōu)于單純PCL-T