TRPC6在PDGF誘導(dǎo)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、目的：支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及其組分共同參與、以可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性炎癥性疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，氣道重塑是其主要特征之一。氣道重塑可引起小氣道阻塞，也是與氣道高反應(yīng)性和哮喘嚴(yán)重程度關(guān)系最為密切的因素。哮喘氣道重塑時(shí)氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生諸多改變，其中包括氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells, ASMCs）肥大和增生等，ASMCs增生與哮喘嚴(yán)重程度和氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切。有效抑制氣道平

2、滑肌細(xì)胞的過度增殖，是治療難治性哮喘的根本途徑。目前參與哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機(jī)制尚不十分清楚。Ca2+參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡[1]，因此一直是細(xì)胞增殖研究中的熱點(diǎn)。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位（canonical transient receptor potenial，TRPC）基因家族被認(rèn)為可編碼介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流的通道，是構(gòu)成鈣庫(kù)操縱性Ca2+通道（store-operated Ca2+channels，SOCs）及受體操縱性

3、Ca2+通道（receptor-operated Ca2+channels，ROCs）的重要分子基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)鈣離子濃度和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，特別是TRPC1和TRPC6。TRPC6還被證實(shí)與哮喘氣道高反應(yīng)性有關(guān)。PDGF作為重要的促有絲分裂原可引起ASMCs的增殖，在哮喘氣道重塑中也發(fā)揮著重要作用，已有研究證實(shí)TRPC6在PDGF誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌（PASMCs）的增殖中發(fā)揮著重要作用[2]，但目前尚未明確在其促進(jìn)ASMCs增

4、殖機(jī)制中是否有TRPC6的參與。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠ASMCs為對(duì)象進(jìn)行研究，
　　以明確TRPC6通道是否參與了PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖，這不僅可以更深入地了解哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，還可以為臨床防治哮喘提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：采用組織貼塊聯(lián)合酶消化法培養(yǎng)原代大鼠ASMCs。用間接免疫熒光法鑒定平滑肌細(xì)胞及檢測(cè)TRPC6在ASMC上的定位。用CCK-8法檢測(cè)PDGF誘導(dǎo)ASMC增殖的模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

5、R檢測(cè)PDGF作用后TRPC1和TRPC6 mRNA的表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)PDGF作用不同時(shí)間后ASMCs中TRPC6蛋白的表達(dá)是否改變。CCK-8法檢測(cè)不同濃度 TRPC6通道的激動(dòng)劑和阻斷劑對(duì) PDGF誘導(dǎo) ASMCs增殖作用的影響。
　　結(jié)果：（1）細(xì)胞免疫熒光顯示：TRPC6存在于氣道平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上；（2） CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)，20ng/ml PDGF作用后 ASMC發(fā)生增殖（相對(duì)于對(duì)照組

6、P<0.05）；PDGF分別與TRPC6通道的激動(dòng)劑1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol（OAG）和flufenamic acid（FFA）及阻斷劑SKF96365共同作用于ASMCs后，ASMCs的增殖較單獨(dú)使用PDGF組出現(xiàn)不同程度的減弱，且減弱的程度與激動(dòng)劑及抑制劑的劑量及作用時(shí)間相關(guān)；而TRPC6通道激動(dòng)劑和抑制劑單獨(dú)作用于ASMCs時(shí)并不影響其增殖。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果示：PDGF分別作用于ASM

7、Cs12h、24h和48h后，ASMCs中TRPC6 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05），而TRPC1的表達(dá)無明顯變化（P>0.05）。（4）Western blot檢測(cè)結(jié)果示：PDGF分別作用于ASMCs24h和48h后，ASMCs中TRPC6蛋白表達(dá)與相應(yīng)的對(duì)照組比較明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）TRPC6位于ASMCs的細(xì)胞膜上。（2）PDGF可以上調(diào)ASMCs中TRPC6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。（3）T