原兒茶醛對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討.pdf

1、[目的]
　　通過(guò)觀察給予原兒茶醛(Protocatechuic Aldehyde，PCA)干預(yù)后大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（Airway Smooth Muscle Cells，ASMCs）增殖能力、細(xì)胞周期、增殖相關(guān)蛋白（ERK-2、P38、JNK-2）、基因(Smad7、TGF-β1、ERK1/2)表達(dá)情況的改變，探討原兒茶醛對(duì)氣道平滑細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，為闡釋其對(duì)支氣管哮喘氣道重構(gòu)的防治作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　[方法]

2、
　　1.雙重酶消化法分離、培養(yǎng)正常大鼠氣道平滑肌細(xì)胞;倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，0.25％胰酶消化傳代;取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　2.正常氣道平滑肌細(xì)胞給予TGF-β1(5ng/ml)5天后，MTT法檢測(cè)吸光度值。
　　3.正常氣道平滑肌細(xì)胞、TGF-β1誘導(dǎo)增殖氣道平滑肌細(xì)胞分別設(shè)空白組(PCA0mol/L)和給藥組(PCA10-5、5×10-5、10-4、5×10-4、10-3mol/L)

3、。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況并確定最有效藥物濃度;運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)活性氧(reactive oxygen species，ROS);蛋白印跡法(Western Blot)測(cè)定蛋白(ERK-2、P38)表達(dá);反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定基因(Smad7、TGF-β1、ERK1/2)表達(dá)。
　　4.采用卵蛋白(VOA)/Al(OH)3腹腔注射致敏，VOA霧化激發(fā)的方法復(fù)制大鼠哮喘模型;分離、

4、培養(yǎng)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞;倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，0.25％胰酶消化傳代;取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　5.哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞設(shè)空白組(PCA0mol/L)、給藥組(PCA10-5、5×10-5、10-4、5×10-4、10-3、5×10-3mol/L)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;運(yùn)用蛋白印跡法(Western Blot)測(cè)定蛋白(P38、JNK-2)表達(dá);反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）測(cè)定基因

5、(Smad7、TGF-β1、ERK1/2)的表達(dá)。
　　[結(jié)果]
　　1.倒置顯微鏡下觀察，傳3代后可獲得均一性較高的氣道平滑肌細(xì)胞，光鏡下細(xì)胞排列呈“峰谷狀”，經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色后細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)α-actin表達(dá)，陽(yáng)性率＞80％，經(jīng)PCR檢測(cè)有α-actin基因表達(dá)。
　　2.TGF-β1對(duì)正常氣道平滑肌細(xì)胞的作用:(1)與空白組相比，TGF-β15ng/ml組細(xì)胞增殖明顯(P＜0.01);(2)TGF-β15ng

6、/ml可明顯增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞增殖。
　　3.PCA對(duì)正常氣道平滑肌細(xì)胞的作用:(1)MTT結(jié)果顯示PCA對(duì)正常氣道平滑肌細(xì)胞增殖存在一定的抑制作用，并且有部分濃度依賴，隨藥物濃度增高抑制作用增強(qiáng)，各濃度組48h時(shí)抑制作用明顯，總體評(píng)價(jià)10-3mol/L、5×10-4mol/L濃度組抑制作用最佳;形態(tài)學(xué)上48h后PCA10-3mol/L組細(xì)胞密度及數(shù)量均不及空白對(duì)照組。(2)10-3mol/L的PCA可

7、以延長(zhǎng)細(xì)胞G1期，使細(xì)胞周期變長(zhǎng)，增殖減慢。(3)PCA10-3mol/L作用48h后氣道平滑肌細(xì)胞ROS表達(dá)較空白組明顯減少，PCA可以降低正常氣道平滑肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。(4)與空白組相比，PCA10-3mol/L組Smad7、TGF-β1、ERK1/2表達(dá)均有明顯改變，Smad7表達(dá)增加，TGF-β1、ERK1/2表達(dá)降低（P均＜0.05）。(5) PCA10-3mol/l組ERK-2、P38表達(dá)均比空白組明顯減少（P均＜0.0

8、5）。
　　4.PCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)增殖氣道平滑肌細(xì)胞的作用:(1)MTT結(jié)果顯示PCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)增殖的氣道平滑肌細(xì)胞24h、48h、72h均存在抑制作用，其中PCA10-5、5×10-5、10-4 mol/L作用最強(qiáng);48h時(shí)給藥組細(xì)胞密度及數(shù)量均不及空白組，10-5 mol/L對(duì)細(xì)胞增殖的抑制較10-4 mol/L明顯。(2)與空白組相比，PCA10-5mol/L、10-4 mol/L組各時(shí)間點(diǎn)處于G2的細(xì)胞所占比

9、例低于空白組，PCA10-5mol/L較10-4mol/L明顯。(3)PCA作用48h后給藥組(PCA10-4、10-5mol/L) ROS表達(dá)比空白組明顯減少，倆給藥組之間無(wú)明顯差別，PCA可以降低TGF-β1誘導(dǎo)增殖氣道平滑肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。(4)與空白組相比給藥組(PCA10-5mol/L) Smad7基因表達(dá)增加，TGF-β1基因表達(dá)降低（P均＞0.05）。(5)PCA10-5mol/L組ERK-2、P38蛋白表達(dá)較空白組均

10、有降低，但降低程度不明顯（P均＞0.05）。
　　5.PCA對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的作用:(1)除10-5mol/L外，其他濃度的PCA對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用24h時(shí)較明顯，5×104mol/L、10-3mol/L、5×10-3mol/L在24h、48h、72h均有抑制性(P＜0.05)。(2)與空白組相比，給藥組(PCA10-3mol/L、5×10-3mol/L) TGF-β1、ERK1/2基因表達(dá)均降低(P＜

11、0.05);PCA10-3mol/L組Smad7基因表達(dá)增加(P＜0.05)，5×10-3mol/L組Smad7表達(dá)改變不明顯。(3)與空白組相比PCA(10-3mol/L)組P38、JNK-2蛋白表達(dá)降低（P均＜0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1.PCA對(duì)正常大鼠氣道平滑肌細(xì)胞、TGF-β1誘導(dǎo)增殖后氣道平滑肌細(xì)胞、哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞均有一定的抑制作用。
　　2.PCA可以降低正常氣道平滑肌細(xì)胞和TGF-β1誘導(dǎo)