神經(jīng)生長因子在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及其促平滑肌細胞增殖的機制研究.pdf

1、哮喘是全球最常見的慢性疾病之一，發(fā)病率逐年增高并造成巨大的經(jīng)濟及社會負擔，因此研究哮喘的發(fā)生、發(fā)展及防治，已成為當前人口與健康領域的前沿課題。近年來氣道重塑，又稱氣道重建或重構，被認為是哮喘發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)，它在哮喘發(fā)病機制和治療中的作用越來越受到關注。氣道重塑是以氣道壁的細胞和分子的組成、數(shù)量和結構的變化為特征的一系列慢性損傷和修復過程，主要表現(xiàn)為細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積、基底膜增厚、

2、氣道平滑肌增生和肥大等。作為哮喘的特征性病理變化，氣道重塑是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴重化的病理基礎，是哮喘中存在的不可逆性氣道阻塞及氣道高反應性的病理基礎，也是激素抵抗性哮喘的病理基礎。治療哮喘必須與防治氣道重塑相結合，才是真正意義上的控制。
　　神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一個成員，對神經(jīng)元的生長、分化起到十分重要的調控作用。然而，近年認為NGF與過敏性氣道炎癥密切相關。NG

3、F可導致人B細胞分化為漿細胞，調節(jié)過敏性炎癥細胞釋放趨化因子及介質，增加中性粒細胞的趨化活性及超氧物質的釋放，及嗜堿性粒細胞釋放組織胺。這些研究提示NGF在哮喘早期階段過敏性氣道炎癥的發(fā)生中起非常重要的作用。然而，NGF在哮喘氣道重塑中的作用如何鮮有報道。
　　近來一些研究證實氣道中的一些固有細胞可能是NGF的靶細胞。NGF可刺激體外培養(yǎng)的肺成纖維細胞的收縮、遷移及促進其分化成肌成纖維細胞。NGF可通過TrkA受體誘導氣道平滑肌細

4、胞增殖，也可誘導MMP9在血管平滑肌細胞上表達。這些體外研究提示NGF可能作用于體內的肺固有細胞參與氣道重塑的形成。
　　細胞周期由細胞周期蛋白(Cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(Cyclin—dependentkinase inhibitor，CKI)進行調節(jié)。細胞周期調控是一個受多種調節(jié)蛋白協(xié)同作用的精細調節(jié)過程。目前，cyclin

5、D1在氣道平滑肌細胞生物學作用被研究得最多。由于cyclin D1在人或動物的惡性疾病中過表達或體外培養(yǎng)細胞或轉基因鼠的試驗中有致腫瘤作用，已被確定為原癌基因。在小牛氣道平滑肌細胞，血小板源生長因子可誘導cyclin D1轉錄激活及蛋白合成，進而導致視網(wǎng)膜成瘤蛋白高度磷酸化，使其釋放延伸因子E2F，從而激活DNA聚合酶。體外實驗研究表明，cyclinD1過度表達與平滑肌細胞的增殖有密切關系，并有研究證實哮喘小鼠模型的肺組織表達較高的cy

6、clin D1。cyclin D1表達增高可促進人氣道平滑肌細胞增殖。已有研究證實NGF通過上調cyclin D1蛋白表達促進PC12細胞的增殖。但是cyclinD1在NGF調節(jié)哮喘氣道平滑肌細胞增殖的作用未見報道。
　　本課題從體內及體外兩方面，研究NGF對哮喘鼠氣道重塑的調節(jié)作用并初步探討相關作用機制，旨在加深對NGF參與哮喘發(fā)病機制的理解，為哮喘防治提供有價值的理論依據(jù)。本項研究共分三部分:
　　第一部分NGF及其中和

7、抗體對哮喘大鼠氣道重塑的影響
　　目的
　　觀察NGF及對哮喘大鼠氣道重塑及肺組織中基質金屬蛋白酶-9(matrixmetalloprotease-9，MMP-9)表達的影響，探討它在哮喘中的作用。
　　方法
　　Wistar大鼠隨機分為對照組、哮喘組、NGF組及NGF中和抗體組。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘大鼠氣道重塑模型;HE染色觀察氣道結構改變;明膠酶譜法檢測各組大鼠肺組織中MM

8、P-9的活性;同時采用real time PCR檢測各組MMP-9的mRNA表達水平。
　　結果
　　(1)NGF組能促進哮喘氣道重塑的特征性病理改變;而NGF中和抗體能部分抑制哮喘氣道重塑的特征性病理改變;(2) NGF組的羥脯氨酸含量、氣道的吸氣和呼氣阻力、肺組織膠原沉積均顯著高于哮喘組，而NGF中和抗體組的羥脯氨酸含量、氣道的吸氣和呼氣阻力、肺組織膠原沉積均顯著低于哮喘組，但仍高于對照組;(3) NGF組肺泡灌洗液白細

9、胞總數(shù)、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞、IL-4及IL-13水平明顯均顯著高于哮喘組，而NGF中和抗體組的肺泡灌洗液白細胞總數(shù)、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞、IL-4及IL-13水平均顯著低于哮喘組，但仍高于對照組;(3)NGF組肺組織MMP-9活性及其mRNA表達水平均明顯高于哮喘組，而NGF中和抗體組肺組織MMP-9活性及其mRNA表達水平均明顯低于哮喘組，但仍高于對照組。
　　結論
　　NGF的干預可顯著加劇哮喘氣道重塑的病理改

10、變，促進氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的增生;并可通過促進肺內MMP-9的表達及Th2細胞因子（IL-4、IL-13）來加劇哮喘氣道重塑的進程。而NGF中和抗體可顯著減輕哮喘氣道重塑的病理改變，部分抑制氣道平滑肌細胞ASMCs的增生。
　　第二部分NGF及其中和抗體對氣道重塑大鼠的氣道平滑肌細胞的作用
　　目的
　　檢測NGF及其中和抗體對氣道重塑大鼠的氣管平滑肌細胞

11、的增殖和移行及表達MMP-9、cyclin D1的影響，從細胞水平探討NGF及中和抗體對哮喘氣道重塑的作用機制。
　　方法
　　原代培養(yǎng)論文一中各組氣管平滑肌細胞。CCK-8法測定細胞增殖活力，流式細胞儀測定細胞周期，Edu染色檢測增殖細胞DNA變化，Transwell檢測細胞移行情況;同時用實時熒光定量PCR及蛋白免疫印記法分別檢測細胞中MMP-9及cyclinD1的表達情況。
　　結果
　　(1) NGF組的

12、ASMCs中細胞增殖活力、EdU陽性表達率明顯高于哮喘組，并促進了細胞周期中G1/S的轉化;而NGF中和抗體組ASMCs細胞增殖活力、EdU陽性表達率明顯低于哮喘組，并抑制了細胞周期中G1/S的轉化(2) NGF組的ASMCs的移行數(shù)明顯多于哮喘組，但是NGF中和抗體組的ASMCs明顯低于哮喘組;(3) NGF組中MMP-9與CyclinD1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于哮喘組，而NGF中和抗體組的MMP-9與CyclinD1的mRN

13、A及蛋白表達水平明顯低于哮喘組。
　　結論
　　NGF能促進氣道重塑大鼠的ASMCs增殖并上調其MMP-9、cyclin D1表達，而NGF中和抗體能部分抑制這種作用。
　　第三部分Cycl in D1在NGF調節(jié)哮喘氣道平滑肌細胞增殖的作用研究
　　目的
　　探討cyclin D1在NGF調節(jié)哮喘氣道平滑肌細胞增殖的作用。
　　方法
　　原代培養(yǎng)急性哮喘大鼠ASMCs并隨機分為兩組:對照組及N

14、GF組。cck-8法測定細胞增殖活力，流式細胞儀測定細胞周期，Edu染色檢測增殖細胞DNA變化;用轉染的方法沉默cyclin D1基因，同時用實時熒光定量PCR及蛋白免疫印記法分別檢測細胞中cyclinD1的表達情況及沉默效率。
　　結果
　　(1) NGF在50ng/ml濃度并不影響哮喘ASMCs的增殖(P＞0.05)，但其在100、150、200ng/ml均可促進哮喘ASMCs的增殖，但不表現(xiàn)為濃度依賴性，故把100ng

15、/ml濃度作為實驗的最佳濃度運用于之后的所有細胞實驗;(2)100ng/ml濃度的NGF對哮喘ASMCs的促增殖作用呈現(xiàn)時間依賴性;(3) NGF顯著促進哮喘ASMCs中EdU陽性表達率，并促進細胞周期中G1/S的轉化;(4) NGF明顯上調哮喘ASMCs中的cyclin D1 mRNA及蛋白表達水平;(5) cyclin D1 siRNA轉染明顯抑制了哮喘ASMCs中cyclin D1的mRNA及蛋白表達水平;(6) cyclin D

16、1 siRNA轉染明顯抑制了NGF促哮喘ASMCs的增殖作用(7) cyclin D1 siRNA轉染哮喘ASMCs后，用NGF刺激哮喘ASMCs，其EdU陽性表達率明顯降低，并明顯抑制了細胞周期中G1/S的轉化;(8)cyclin D1 siRNA轉染抑制了NGF上調哮喘ASMCs中的cyclin D1mRNA及蛋白表達水平。
　　結論
　　NGF能促進哮喘鼠ASMCs的增殖，并上調cyclin D1表達。cyclin D