神經(jīng)生長因子在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及其促平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、哮喘是全球最常見的慢性疾病之一，發(fā)病率逐年增高并造成巨大的經(jīng)濟(jì)及社會負(fù)擔(dān)，因此研究哮喘的發(fā)生、發(fā)展及防治，已成為當(dāng)前人口與健康領(lǐng)域的前沿課題。近年來氣道重塑，又稱氣道重建或重構(gòu)，被認(rèn)為是哮喘發(fā)病機(jī)制中的一個重要環(huán)節(jié)，它在哮喘發(fā)病機(jī)制和治療中的作用越來越受到關(guān)注。氣道重塑是以氣道壁的細(xì)胞和分子的組成、數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化為特征的一系列慢性損傷和修復(fù)過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、基底膜增厚、

2、氣道平滑肌增生和肥大等。作為哮喘的特征性病理變化，氣道重塑是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，是哮喘中存在的不可逆性氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性的病理基礎(chǔ)，也是激素抵抗性哮喘的病理基礎(chǔ)。治療哮喘必須與防治氣道重塑相結(jié)合，才是真正意義上的控制。
　　神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一個成員，對神經(jīng)元的生長、分化起到十分重要的調(diào)控作用。然而，近年認(rèn)為NGF與過敏性氣道炎癥密切相關(guān)。NG

3、F可導(dǎo)致人B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，調(diào)節(jié)過敏性炎癥細(xì)胞釋放趨化因子及介質(zhì)，增加中性粒細(xì)胞的趨化活性及超氧物質(zhì)的釋放，及嗜堿性粒細(xì)胞釋放組織胺。這些研究提示NGF在哮喘早期階段過敏性氣道炎癥的發(fā)生中起非常重要的作用。然而，NGF在哮喘氣道重塑中的作用如何鮮有報道。
　　近來一些研究證實氣道中的一些固有細(xì)胞可能是NGF的靶細(xì)胞。NGF可刺激體外培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞的收縮、遷移及促進(jìn)其分化成肌成纖維細(xì)胞。NGF可通過TrkA受體誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)

4、胞增殖，也可誘導(dǎo)MMP9在血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)。這些體外研究提示NGF可能作用于體內(nèi)的肺固有細(xì)胞參與氣道重塑的形成。
　　細(xì)胞周期由細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase，CDK)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(Cyclin—dependentkinase inhibitor，CKI)進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期調(diào)控是一個受多種調(diào)節(jié)蛋白協(xié)同作用的精細(xì)調(diào)節(jié)過程。目前，cyclin

5、D1在氣道平滑肌細(xì)胞生物學(xué)作用被研究得最多。由于cyclin D1在人或動物的惡性疾病中過表達(dá)或體外培養(yǎng)細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因鼠的試驗中有致腫瘤作用，已被確定為原癌基因。在小牛氣道平滑肌細(xì)胞，血小板源生長因子可誘導(dǎo)cyclin D1轉(zhuǎn)錄激活及蛋白合成，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜成瘤蛋白高度磷酸化，使其釋放延伸因子E2F，從而激活DNA聚合酶。體外實驗研究表明，cyclinD1過度表達(dá)與平滑肌細(xì)胞的增殖有密切關(guān)系，并有研究證實哮喘小鼠模型的肺組織表達(dá)較高的cy

6、clin D1。cyclin D1表達(dá)增高可促進(jìn)人氣道平滑肌細(xì)胞增殖。已有研究證實NGF通過上調(diào)cyclin D1蛋白表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞的增殖。但是cyclinD1在NGF調(diào)節(jié)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用未見報道。
　　本課題從體內(nèi)及體外兩方面，研究NGF對哮喘鼠氣道重塑的調(diào)節(jié)作用并初步探討相關(guān)作用機(jī)制，旨在加深對NGF參與哮喘發(fā)病機(jī)制的理解，為哮喘防治提供有價值的理論依據(jù)。本項研究共分三部分:
　　第一部分NGF及其中和

7、抗體對哮喘大鼠氣道重塑的影響
　　目的
　　觀察NGF及對哮喘大鼠氣道重塑及肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloprotease-9，MMP-9)表達(dá)的影響，探討它在哮喘中的作用。
　　方法
　　Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、哮喘組、NGF組及NGF中和抗體組。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘大鼠氣道重塑模型;HE染色觀察氣道結(jié)構(gòu)改變;明膠酶譜法檢測各組大鼠肺組織中MM

8、P-9的活性;同時采用real time PCR檢測各組MMP-9的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　(1)NGF組能促進(jìn)哮喘氣道重塑的特征性病理改變;而NGF中和抗體能部分抑制哮喘氣道重塑的特征性病理改變;(2) NGF組的羥脯氨酸含量、氣道的吸氣和呼氣阻力、肺組織膠原沉積均顯著高于哮喘組，而NGF中和抗體組的羥脯氨酸含量、氣道的吸氣和呼氣阻力、肺組織膠原沉積均顯著低于哮喘組，但仍高于對照組;(3) NGF組肺泡灌洗液白細(xì)

9、胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞、IL-4及IL-13水平明顯均顯著高于哮喘組，而NGF中和抗體組的肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞、IL-4及IL-13水平均顯著低于哮喘組，但仍高于對照組;(3)NGF組肺組織MMP-9活性及其mRNA表達(dá)水平均明顯高于哮喘組，而NGF中和抗體組肺組織MMP-9活性及其mRNA表達(dá)水平均明顯低于哮喘組，但仍高于對照組。
　　結(jié)論
　　NGF的干預(yù)可顯著加劇哮喘氣道重塑的病理改

10、變，促進(jìn)氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)的增生;并可通過促進(jìn)肺內(nèi)MMP-9的表達(dá)及Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-13）來加劇哮喘氣道重塑的進(jìn)程。而NGF中和抗體可顯著減輕哮喘氣道重塑的病理改變，部分抑制氣道平滑肌細(xì)胞ASMCs的增生。
　　第二部分NGF及其中和抗體對氣道重塑大鼠的氣道平滑肌細(xì)胞的作用
　　目的
　　檢測NGF及其中和抗體對氣道重塑大鼠的氣管平滑肌細(xì)胞

11、的增殖和移行及表達(dá)MMP-9、cyclin D1的影響，從細(xì)胞水平探討NGF及中和抗體對哮喘氣道重塑的作用機(jī)制。
　　方法
　　原代培養(yǎng)論文一中各組氣管平滑肌細(xì)胞。CCK-8法測定細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期，Edu染色檢測增殖細(xì)胞DNA變化，Transwell檢測細(xì)胞移行情況;同時用實時熒光定量PCR及蛋白免疫印記法分別檢測細(xì)胞中MMP-9及cyclinD1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　(1) NGF組的

12、ASMCs中細(xì)胞增殖活力、EdU陽性表達(dá)率明顯高于哮喘組，并促進(jìn)了細(xì)胞周期中G1/S的轉(zhuǎn)化;而NGF中和抗體組ASMCs細(xì)胞增殖活力、EdU陽性表達(dá)率明顯低于哮喘組，并抑制了細(xì)胞周期中G1/S的轉(zhuǎn)化(2) NGF組的ASMCs的移行數(shù)明顯多于哮喘組，但是NGF中和抗體組的ASMCs明顯低于哮喘組;(3) NGF組中MMP-9與CyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于哮喘組，而NGF中和抗體組的MMP-9與CyclinD1的mRN

13、A及蛋白表達(dá)水平明顯低于哮喘組。
　　結(jié)論
　　NGF能促進(jìn)氣道重塑大鼠的ASMCs增殖并上調(diào)其MMP-9、cyclin D1表達(dá)，而NGF中和抗體能部分抑制這種作用。
　　第三部分Cycl in D1在NGF調(diào)節(jié)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用研究
　　目的
　　探討cyclin D1在NGF調(diào)節(jié)哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用。
　　方法
　　原代培養(yǎng)急性哮喘大鼠ASMCs并隨機(jī)分為兩組:對照組及N

14、GF組。cck-8法測定細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期，Edu染色檢測增殖細(xì)胞DNA變化;用轉(zhuǎn)染的方法沉默cyclin D1基因，同時用實時熒光定量PCR及蛋白免疫印記法分別檢測細(xì)胞中cyclinD1的表達(dá)情況及沉默效率。
　　結(jié)果
　　(1) NGF在50ng/ml濃度并不影響哮喘ASMCs的增殖(P＞0.05)，但其在100、150、200ng/ml均可促進(jìn)哮喘ASMCs的增殖，但不表現(xiàn)為濃度依賴性，故把100ng

15、/ml濃度作為實驗的最佳濃度運(yùn)用于之后的所有細(xì)胞實驗;(2)100ng/ml濃度的NGF對哮喘ASMCs的促增殖作用呈現(xiàn)時間依賴性;(3) NGF顯著促進(jìn)哮喘ASMCs中EdU陽性表達(dá)率，并促進(jìn)細(xì)胞周期中G1/S的轉(zhuǎn)化;(4) NGF明顯上調(diào)哮喘ASMCs中的cyclin D1 mRNA及蛋白表達(dá)水平;(5) cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染明顯抑制了哮喘ASMCs中cyclin D1的mRNA及蛋白表達(dá)水平;(6) cyclin D

16、1 siRNA轉(zhuǎn)染明顯抑制了NGF促哮喘ASMCs的增殖作用(7) cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染哮喘ASMCs后，用NGF刺激哮喘ASMCs，其EdU陽性表達(dá)率明顯降低，并明顯抑制了細(xì)胞周期中G1/S的轉(zhuǎn)化;(8)cyclin D1 siRNA轉(zhuǎn)染抑制了NGF上調(diào)哮喘ASMCs中的cyclin D1mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論
　　NGF能促進(jìn)哮喘鼠ASMCs的增殖，并上調(diào)cyclin D1表達(dá)。cyclin D