瞬時(shí)受體電位通道6在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、目的：
　　 用血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）刺激培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（Aortic smooth muscle cell，ASMC）增殖以建立細(xì)胞增殖模型，應(yīng)用Western blot技術(shù)、MTT 法和鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)平滑肌細(xì)胞（SMC）中的瞬時(shí)受體電位通道6（Transient receptor potential channel 6,TRPC6）通道蛋白表達(dá)情況、細(xì)胞增殖能力變化和細(xì)胞內(nèi)鈣離

2、子濃度的變化，以此來(lái)評(píng)價(jià)TRPC6在AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠ASMC異常增殖中的作用并初步分析其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)雄性SD大鼠，體重150～200 g，清潔級(jí)。頸椎脫臼處死，無(wú)菌取出大鼠胸主動(dòng)脈，放入D-Hanks液中反復(fù)沖洗，洗去血污，在緩沖液中剝凈外膜，去除內(nèi)膜，取血管中膜，剪成約1～3 mm2的小組織塊接種于直徑為35mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)基為DMEM，成分包括20％胎牛血清，L-谷氨酰胺（2 m

3、M），青霉素（100 units/mL），鏈霉素（100 μg/mL）。將培養(yǎng)皿置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3天換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合約80％時(shí)，進(jìn)行傳代。
　　 2.形態(tài)學(xué)和免疫熒光雙標(biāo)染色鑒定取第3～5代細(xì)胞，用形態(tài)學(xué)和免疫反應(yīng)兩種方法鑒定SMC。首先在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)、外形、生長(zhǎng)特點(diǎn)、排列方式等，然后選擇處于合適的生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，進(jìn)行消化，接種到蓋玻片作細(xì)胞爬片，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取出，用PBS洗10 m

4、in×3次，用預(yù)冷的4％多聚甲醛4℃固定20 min，再用5％BSA室溫封閉60 min，滴加適當(dāng)稀釋度的一抗，4℃孵育，>14 hrs，PBS洗10 min×3次，滴加適度稀釋的熒光標(biāo)記二抗，避光，37℃孵育1 h。PBS洗后滴加DAPI液（5μg/mL），室溫避光顯色15min，熒光顯微鏡下觀察，拍照。
　　 3.Western blot 分析實(shí)驗(yàn)用第3～5代ASMC，當(dāng)80％的細(xì)胞長(zhǎng)到融合一起以后，加 4℃預(yù)冷的PBS（0

5、.01 M，pH 7.2～7.3），洗滌細(xì)胞，重復(fù)以上操作兩次。將PBS棄凈后把培養(yǎng)皿置于冰上。加入1 ml預(yù)冷的單去污劑裂解液（50 mmol/L Tris·HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1％TritonX-100，100 μg/mL PMSF）裂解細(xì)胞，置冰上裂解5～10 min。用細(xì)胞刮把裂解好的細(xì)胞刮下來(lái)，轉(zhuǎn)移到EP管中，超聲震蕩后，4℃冷凍離心機(jī)以12000 r/min的速度離心15min，用BCA法檢

6、測(cè)總蛋白濃度。取樣本于10％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，蛋白80 V恒壓濕轉(zhuǎn)入PVDF膜上，5％脫脂牛奶室溫封閉30 min，孵一抗4°C過(guò)夜，0.05％ PBS-T洗膜3×10 min，室溫共同孵育二抗和HRP-actin抗體1.5h，0.05％ PBS-T洗膜3×10 min，暗室中ECL顯色后曝光。
　　 4.細(xì)胞分組與處理①空白組；② AngⅡ組：加入0.1 μmol/L的AngⅡ；③SKF96365+AngⅡ

7、組：AngⅡ（0.1μmol/L）和不同濃度的SKF96365（10，50，100μmol/L）；④flufenamic acid組：不同濃度的flufenamic acid（FFA，10，20，40μmol/L）。
　　 5.MTT 法檢測(cè)選擇3～5代ASMC，在37℃用胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞約1 min,制備細(xì)胞懸液，接著以1000 r/min速度離心8 min，棄上清，用含20％胎牛血清的培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度2.5×

8、104個(gè)/mL，接種于96孔板，37℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)。24 h后換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h后換液，分別加各種處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)24 h到72 h。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別于藥物作用結(jié)束前4 h，每孔加5mg/mL MTT 20 μl，4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μl二甲基亞砜，振蕩使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。
　　 6.鈣離子成像鈣離子成像技術(shù)可監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca

9、2+濃度（[Ca2+]I）的變化。首先準(zhǔn)備好直徑為25mm的培養(yǎng)皿，把底部的中心挖直徑為10mm的孔，用膠粘上一個(gè)厚0.1 mm的蓋玻片，然后細(xì)胞被低濃度接種于這個(gè)蓋玻片上，細(xì)胞至少培養(yǎng)24 h才能做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)先在37°C用含有4 μmol/L的Fura-2/AM的外液孵育ASMC，40min。[Ca2+]I的測(cè)量采用一種 Ca2+敏感性的熒光染料Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2/AM)。結(jié)合 Ca

10、2+的Fura-2/AM的激發(fā)光波長(zhǎng)是340 nm，未結(jié)合 Ca2+的Fura-2/AM的激發(fā)光波長(zhǎng)是380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)均為510 nm。這樣就可以用340 nm和380 nm 這兩個(gè)熒光的比值定量 [Ca2+]I的變化。利用鈣離子成像分析軟件TILLvision軟件，可實(shí)時(shí)檢測(cè) [Ca2+]I的變化。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較MTT法檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)，鈣成像數(shù)據(jù)用Igor Pro軟件進(jìn)行統(tǒng)

11、計(jì)分析，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以±s表示，p<0.05認(rèn)為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.鑒定結(jié)果①在相差顯微鏡下，細(xì)胞外觀多為長(zhǎng)梭形、多角形或不規(guī)則形狀。核呈圓形、卵圓形。細(xì)胞可出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象，呈“峰-谷樣”生長(zhǎng)。②免疫熒光鑒定結(jié)果顯示抗肌球蛋白抗體染色陽(yáng)性，表明所獲細(xì)胞為SMC，細(xì)胞純度達(dá)95％以上。
　　 2.Western blot 分析用轉(zhuǎn)染TRPC6基因

12、的HEK293細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照和轉(zhuǎn)染空白媒介的HEK293細(xì)胞作為陰性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在正常的大鼠ASMC中有很高水平的TRPC6通道蛋白表達(dá)。
　　 3.MTT法檢測(cè)不同濃度的SKF96365(10，50，100 μmol/L) 處理 ASMC以后，與AngⅡ組相比，細(xì)胞的增殖活性有顯著性地降低，并呈濃度依賴性（p<0.05）。而用不同濃度FFA (10，20，40 μmol/L) 處理細(xì)胞后，與空白組相比，ASMC增殖活力明顯升高（

13、p<0.05）。
　　 4.鈣離子成像 FFA (TRPC6通道激動(dòng)劑，50 μmol/L) 對(duì)Ang Ⅱ(1 μmol/L) 引起的[Ca2+]I的升高沒(méi)有明顯的影響（n=8，p＞0.05）。SKF96365(TRPC通道阻滯劑，50 μmol/L) 對(duì)Ang Ⅱ(1 μmol/L) 引起的細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度的升高有明顯的抑制作用（n=10，p<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 TRPC6通道蛋白在正常的胸主動(dòng)