VEGF、Flk-1在低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、研究背景及目的：肺動脈高壓是臨床上許多常見疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，同時也是多病因、迄今發(fā)病機(jī)制仍不清楚的一種疾病。肺血管重塑是肺動脈高壓的主要病理變化特征，慢性低氧是引起肺血管重塑的最常見因素之一。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)通過其特異性受體，尤其是KDR/Flk-1引起細(xì)胞增殖，目前研究發(fā)現(xiàn)，VEGF不僅對內(nèi)皮細(xì)胞而且對血管平滑肌細(xì)胞，上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞都有增殖作用。 除了血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性成份以旁分

2、泌的方式調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮和增殖外，血管平滑肌細(xì)胞本身也能以自分泌的方式產(chǎn)生許多血管活性成份。研究表明，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞通過旁分泌VEGF在低氧性肺動脈高壓(HPH)的發(fā)生中起重要作用，但低氧能否通過影響平滑肌細(xì)胞自分泌VEGF而參與低氧性肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重建尚未見報道。 本研究通過觀察整體動物低氧情況下及體外低氧培養(yǎng)的PASMCs增殖情況及VEGF，F(xiàn)lk-1表達(dá)變化，探討PASMCs能否自分泌VEGF，VEGF在低氧性PASM

3、Cs增殖中的作用及其機(jī)制。 一大鼠慢性低氧時肺小動脈中VEGF，F(xiàn)lk-1表達(dá)的變化1.實驗方法利用低壓低氧艙建立大鼠低氧性肺動脈高壓模型，實驗分為三組：常氧對照組，低氧2周組，低氧3周組。分別稱量右心室(R)、左心室+室間隔的重量(L+S)和體質(zhì)量(BW)，計算R/(L+S)和R/BW以反映PAH的嚴(yán)重程度；肺小動脈HE染色后，光鏡下觀察血管增殖情況；免疫組化和圖像分析的方法檢測主動脈及肺內(nèi)小動脈中VEGF，PCNA，F(xiàn)lk-

4、1的表達(dá)和含量的變化。 2.實驗結(jié)果(1)右心室肥厚的檢測：與常氧對照組相比較，低氧2周組及低氧3周組的R/L+S及R/BW的比值均有顯著增加(P＜0.01)，表明低氧組大鼠的右心室肥厚。 (2)病理檢查：與常氧對照組大鼠相比低氧2周組大鼠的肺小動脈壁增厚，管腔顯著縮小，低氧3周組的大鼠肺小動脈壁增厚更加明顯。 (3)PCNA表達(dá)變化：PCNA在常氧對照組大鼠的主動脈、肺內(nèi)小動脈平滑肌內(nèi)均有微弱表達(dá)；低氧組中只有

5、在肺內(nèi)小動脈平滑肌內(nèi)其表達(dá)增強(qiáng)，其中低氧3周組中的表達(dá)又強(qiáng)于低氧2周組；主動脈內(nèi)，PCNA的表達(dá)各處理組間無明顯差別。 (4)VEGF表達(dá)變化：結(jié)果顯示，與常氧對照組比較，低氧組大鼠的肺內(nèi)小動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)，VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并隨低氧時間的延長而增加，但其在主動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量在各組之間無顯著差別。 (5)Flk-1表達(dá)的變化：結(jié)果顯示，F(xiàn)lk-1在三組大鼠的主動脈，肺內(nèi)小動脈平滑肌內(nèi)均有表達(dá)，且無明顯差異。

6、 3.小結(jié)：在整體動物水平，慢性低氧刺激可以引起肺動脈壁增厚，在肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)量增加，F(xiàn)lk-1表達(dá)無顯著改變。 二、低氧對培養(yǎng)的PASMCs表達(dá)VEGF、Flk-1的影響1.實驗方法實驗分為常氧組、低氧組和低氧+阻斷劑組；MTT法及PCNA免疫組化法染色檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；Westernblot及ELISA法測PASMCs內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF蛋白表達(dá)；FITC法檢測體外培養(yǎng)

7、的PASMCs上Flk-1表達(dá)量的變化。 2.實驗結(jié)果(1)低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖：MTT結(jié)果顯示，低氧培養(yǎng)24h組OD值顯著高于對照組(P＜0.01)；阻斷劑組OD值低于低氧培養(yǎng)24h組(P＜0.05)；免疫組化結(jié)果顯示低氧24h組PCNA蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P＜0.01)；阻斷劑組的PCNA蛋白表達(dá)則低于低氧組(P＜0.05)。結(jié)果提示VEGFR2阻斷劑可抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖。 (2)低氧對培養(yǎng)的PA

8、SMCs細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析顯示，常氧組PASMCs處于G0/G1期、S+G2/M期的細(xì)胞比例分別為71.5％和27.8％，低氧組分別為55.6％和44.3％，說明低氧可引起PASMCs由G1期向S期轉(zhuǎn)化，處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞增加；低氧+阻斷劑組分別為65.8％和34.2％，說明VEGFR2阻斷劑可抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化。 (3)低氧時VEGF蛋白在PASMCs中的表達(dá)變化：Westernblot結(jié)

9、果顯示低氧組PASMCs內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)比常氧組顯著增高(P＜0.05)，提示低氧可能引起PASMCs表達(dá)VEGF蛋白水平增多。低氧+阻斷劑組VEGF蛋白表達(dá)較低氧組明顯降低(P＜0.05)，提示阻斷劑可以降低PASMCs內(nèi)VEGF的表達(dá)。 (4)VEGF蛋白在低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs培養(yǎng)液上清中的表達(dá)變化：ELISA結(jié)果顯示低氧組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF含量(236.56±12.34ng/L/106cell)比對照組(10

10、6.32±7.66ng/L/106cell)明顯增高(P＜0.01)，提示低氧可引起PASMCs分泌到培養(yǎng)液中的VEGF增多。阻斷劑組培養(yǎng)液上清中VEGF含量(212.39±10.86ng/L/106cell)與低氧組無顯著差異，提示VEGFR2阻斷劑并不影響低氧刺激PASMCs的VEGF分泌。 (5)Flk-1在低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs中的蛋白表達(dá)變化：低氧組PASMCs細(xì)胞膜上Flk-1表達(dá)增多，提示低氧可能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的