重組腈水合酶NHaseK的功能表達(dá)及分子改造.pdf

1、腈水合酶(EC4.2.1.84)可催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)水合生成相應(yīng)的酰胺，用于合成高效殺蟲劑氰戊菊酯的重要前體戊菊酸。但目前報道的可轉(zhuǎn)化CPIN的腈水合酶數(shù)量較少且活性較低，極大地限制了催化效率。因此，對腈水合酶的重組表達(dá)及分子改造進(jìn)行研究，改善其催化活性具有重要意義。
　　本文以實驗室前期獲得的對CPIN有高活性的腈水合酶NHaseK為研究對象，構(gòu)建了其在大腸桿菌中的功能表達(dá)體系。利用pETDuet-

2、1具有雙T7啟動子的優(yōu)勢，將NHaseK功能表達(dá)必須具備的α亞基、β亞基和活化元件17k以八種不同的組合方式插入于兩個啟動子之下。當(dāng)將三段基因以基因簇形式共同插入于第一個啟動子之下時，亞基表達(dá)量均衡、活化元件充分表達(dá)，酶活表現(xiàn)最佳，比活為0.78 U/mg蛋白。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)粒及SD序列對大腸桿菌表達(dá)NHaseK的影響不明顯?？紤]到pRSFDuet-1的卡那霉素抗性更適于發(fā)酵，確定以此為載體重組表達(dá)NHaseK，粗酶活力為222

3、.6 U/L。
　　其次，采用同源建模和分子對接構(gòu)建NHaseK-CPIN復(fù)合物構(gòu)象，以此為基礎(chǔ)改造NHaseK。一方面，通過虛擬丙氨酸掃描篩選出10個突變熱點，根據(jù)它們的虛擬飽和突變結(jié)果選擇αG119進(jìn)行飽和突變實驗，但效果不佳;根據(jù)它們的丙氨酸突變實驗結(jié)果選擇βD49和αQ88進(jìn)行飽和突變，獲得14株正向突變子，其中βD49G活性最高，其比活為2.48 U/mg蛋白，是原始酶NHaseK的3.2倍。另一方面，選擇預(yù)測通道附近的

4、大位阻殘基βF41進(jìn)行飽和突變，未能獲得正向突變子。進(jìn)一步對正向突變子進(jìn)行組合突變，未能獲得理想突變子。
　　最后，考察βD49G及NHaseK的酶學(xué)性質(zhì)并初步探索催化CPIN工藝。發(fā)現(xiàn)βD49G的Kat增大4.4倍，是其活性提升的主要原因。此外β49G熱穩(wěn)定性也都有所提升，其在35℃、40℃、45℃的半衰期分別為114 h、76 h、25 h，較原始酶NHaseK分別延長39％、72％、56％。初步探索重組菌E.coli/pRS