脂肪酶基因的克隆表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究和分子改造.pdf

1、生物柴油是新興的“綠色能源”，大力發(fā)展生物柴油對(duì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展、推進(jìn)能源替代、減輕環(huán)境壓力、控制城市大氣污染具有重要的戰(zhàn)略意義。脂肪酶能夠催化油類(lèi)和醇通過(guò)酯交換反應(yīng)生成生物柴油，不但反應(yīng)條件溫和，且反應(yīng)副產(chǎn)物少、產(chǎn)物易于分離，然而由于酶的活力低、易受甲醇抑制等問(wèn)題使得生物柴油轉(zhuǎn)化率較低，難以形成大規(guī)模生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)意在通過(guò)對(duì)微生物脂肪酶基因的異源表達(dá)和定向進(jìn)化獲得酶活力和甲醇耐受性適于催化生物柴油的菌株，使其能更有效地催化生成生物柴油，并

2、且是國(guó)內(nèi)首次對(duì)釀酒酵母脂肪酶基因的克隆、重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。
　　 克隆了釀酒酵母脂肪酶基因TGL3，構(gòu)建了表達(dá)載體pSE380-TGL3、pET-22b-TGL3和口pPIC9K-TGL3。將pSE380-TGL3和IpET-22b-TGL3分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)沒(méi)有檢測(cè)到酶活，SDS-PAGE分析也沒(méi)檢測(cè)到目的表達(dá)條帶，基因TGL3在大腸桿菌中表達(dá)失

3、敗。將pPIC9K-TGL3轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GSll5中，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵120h時(shí)發(fā)酵液粗酶活力達(dá)到最大為60U/mL，是野生酶的10倍。SDS-PAGE分析，表達(dá)蛋白大小約為70kD。酶學(xué)性質(zhì)分析得知該酶的最適作用溫度為40℃，最適pH為8.5，Tm為45。C，在pH8-9之間較穩(wěn)定，Km值約為3.3mg/mL，大多數(shù)金屬離子對(duì)該酶沒(méi)有影響。
　　 分別采用易錯(cuò)PCR和反向PCR技術(shù)對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因LIPA進(jìn)行了隨

4、機(jī)突變和定點(diǎn)突變，最終獲得四個(gè)有酶活力的突變體：epl、ep2、E122F和D388I。分別對(duì)野生型和突變型脂肪酶進(jìn)行了鎳柱親和層析純化和純化酶酶學(xué)性質(zhì)分析，純化后只有大小為64kD的單一蛋白條帶，酶學(xué)性質(zhì)分析表明：突變體epl的比活力比野生型提高了425U/mg;epl和D388I的Tm分別比野生型提高了3℃和2℃；ep2、E122F和D388I的最適反應(yīng)溫度分別由野生型的40℃降低為25℃、30℃和25℃；除E122F外其余三個(gè)突變