脂肪酶基因的克隆表達、酶學性質(zhì)研究和分子改造.pdf

1、生物柴油是新興的“綠色能源”，大力發(fā)展生物柴油對經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展、推進能源替代、減輕環(huán)境壓力、控制城市大氣污染具有重要的戰(zhàn)略意義。脂肪酶能夠催化油類和醇通過酯交換反應(yīng)生成生物柴油，不但反應(yīng)條件溫和，且反應(yīng)副產(chǎn)物少、產(chǎn)物易于分離，然而由于酶的活力低、易受甲醇抑制等問題使得生物柴油轉(zhuǎn)化率較低，難以形成大規(guī)模生產(chǎn)。本實驗意在通過對微生物脂肪酶基因的異源表達和定向進化獲得酶活力和甲醇耐受性適于催化生物柴油的菌株，使其能更有效地催化生成生物柴油，并

2、且是國內(nèi)首次對釀酒酵母脂肪酶基因的克隆、重組表達及酶學性質(zhì)進行研究。
　　 克隆了釀酒酵母脂肪酶基因TGL3，構(gòu)建了表達載體pSE380-TGL3、pET-22b-TGL3和口pPIC9K-TGL3。將pSE380-TGL3和IpET-22b-TGL3分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta細胞中，誘導表達沒有檢測到酶活，SDS-PAGE分析也沒檢測到目的表達條帶，基因TGL3在大腸桿菌中表達失

3、敗。將pPIC9K-TGL3轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GSll5中，用甲醇誘導表達，發(fā)酵120h時發(fā)酵液粗酶活力達到最大為60U/mL，是野生酶的10倍。SDS-PAGE分析，表達蛋白大小約為70kD。酶學性質(zhì)分析得知該酶的最適作用溫度為40℃，最適pH為8.5，Tm為45。C，在pH8-9之間較穩(wěn)定，Km值約為3.3mg/mL，大多數(shù)金屬離子對該酶沒有影響。
　　 分別采用易錯PCR和反向PCR技術(shù)對粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因LIPA進行了隨

4、機突變和定點突變，最終獲得四個有酶活力的突變體：epl、ep2、E122F和D388I。分別對野生型和突變型脂肪酶進行了鎳柱親和層析純化和純化酶酶學性質(zhì)分析，純化后只有大小為64kD的單一蛋白條帶，酶學性質(zhì)分析表明：突變體epl的比活力比野生型提高了425U/mg;epl和D388I的Tm分別比野生型提高了3℃和2℃；ep2、E122F和D388I的最適反應(yīng)溫度分別由野生型的40℃降低為25℃、30℃和25℃；除E122F外其余三個突變