兩種α-淀粉酶基因克隆表達及分子改造.pdf

1、淀粉酶是已商業(yè)化且應用最廣泛的酶制劑之一，隨著淀粉應用范圍的不斷擴展，對淀粉酶的酶學性質(zhì)要求會越來越多、越來越專業(yè)化以適應不同類型的反應。發(fā)現(xiàn)和改造獲得更多的具有特殊性質(zhì)的酶資源，為淀粉酶的工業(yè)化應用提供必要的前提條件。
　　 本研究從自然界篩選到兩株高產(chǎn)淀粉酶的野生菌株，初步鑒定為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）和芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)，分別命名為GXT-6和GXBA-4。利用簡并PCR成功地從菌株

2、Streptomycessp.GXT-6的基因組DNA中克隆到一個α-淀粉酶基因，并在大腸桿菌成功表達。通過酶學性質(zhì)研究，該酶的最適溫度為55℃，最適pH為7.0，高效液相色譜技術(shù)(HPLC)檢測其水解淀粉產(chǎn)物主要為麥芽糖、麥芽三糖以及麥芽四糖，不含有葡萄糖，在麥芽糖漿生產(chǎn)工業(yè)上有很大的應用前景。
　　 利用超濾，凝膠過濾和硫酸銨沉淀等方法從野生菌Bacillussp.GXBA-4的發(fā)酵液中分離純化到單一的α-淀粉酶組分，利用質(zhì)

3、譜技術(shù)(MS)測定該酶的部分氨基酸序列，從而成功的克隆到Bacillussp.GXBA-4α-淀粉酶基因，并成功表達。通過酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適溫度為40℃-45℃，最適pH為5.0，產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖及麥芽三糖等多種低聚糖混合物，是一種偏低溫酸性α-淀粉酶，在食品和淀粉加工行業(yè)將有一定的應用前景。
　　 本研究以已有三維晶體結(jié)構(gòu)的Bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶（PDBID為3BH4A）為

4、模板，通過SWISS-MODEL網(wǎng)站對Bacillusamyloliquefaciensα-淀粉酶基因進行同源建模，通過ProSa2003能量分析軟件預測，對Bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶催化位點附近的Q295、P362進行了定點飽和突變，結(jié)果獲得4個有淀粉酶活力的突變子Q295G、Q295Y和P362E、P362Y。與野生酶相比，Q295G和Q295Y的比活力稍有提高，P362E比活力下降了20倍，P3