重組復(fù)合脫硫酶的構(gòu)建及高效表達(dá).pdf

1、煤炭在燃燒過(guò)程中會(huì)排放出二氧化硫等有害物質(zhì)，對(duì)人體健康、植被、金屬、建筑和生態(tài)環(huán)境都產(chǎn)生不利影響。煤的生物脫硫技術(shù)因菌株脫硫能力單一、脫硫效率低等原因，應(yīng)用受到限制。因此，本文論文以前期已獲得的無(wú)機(jī)硫脫除菌株氧化亞鐵硫桿菌L1、有機(jī)硫脫除菌株D4為出發(fā)菌株，利用基因工程技術(shù)，改造微生物的脫硫能力，構(gòu)建了一株能同時(shí)脫除原煤中有機(jī)硫和無(wú)機(jī)硫的工程菌，為生物脫硫的工業(yè)化應(yīng)用提供有意義的參考。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　1、

2、結(jié)合原始菌株L1脫無(wú)機(jī)硫和D4脫有機(jī)硫的能力，建立多菌株兩步法脫硫技術(shù)，并考察原煤中硫化物的生物瀝濾效果。煤中的全硫含量用元素分析儀測(cè)定，黃鐵礦硫含量和硫酸鹽硫含量由國(guó)標(biāo)法（GB/T215-2003）進(jìn)行測(cè)定，原煤脫硫前后經(jīng)掃描電鏡（SEM）、傅里葉紅外（FTIR）、X射線衍射（XRD）和熱重（TG）等方法分析。結(jié)果顯示，經(jīng)兩步法生物瀝濾后，煤表面出現(xiàn)明顯腐蝕痕跡，煤中全硫的脫硫率達(dá)到51％，黃鐵礦硫脫硫率約為52.1%，有機(jī)硫脫硫率達(dá)

3、到39.5%，微生物脫硫過(guò)程中，煤中的化學(xué)鍵和成分晶形均發(fā)生變化，有利于硫分的去除，并且原煤的燃燒熱值沒(méi)有降低，可見(jiàn)兩步法生物脫硫可實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)機(jī)硫和有機(jī)硫的同時(shí)脫除。
　　2、重組復(fù)合脫硫酶的表達(dá)：首先以L1菌的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆得到脫無(wú)機(jī)硫酶基因CysH，大小約為783 bp；其次以D4菌的總DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得目的脫有機(jī)硫酶基因DszA、DszB和DszC，大小分別為1374 bp，1110

4、bp，1266 bp。利用OE-PCR擴(kuò)增技術(shù)，連接四段目的基因，得到脫硫酶操縱子DszA-DszB-DszC-CysH，以pET-28a(+)為表達(dá)載體構(gòu)建重組脫硫操縱子表達(dá)載體pET-DszA-DszB-DszC-CysH（簡(jiǎn)寫(xiě)為pET-Dsz-CysH），用電擊轉(zhuǎn)化方法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體菌 E.Coli BL21（DE3），培養(yǎng)得到一株脫硫基因工程菌 E. Coli BL21(DE3-pET-Dsz-CysH)(簡(jiǎn)稱L-D）。

5、
　　3、重組脫硫酶活性研究：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)基因工程菌L-D所表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)，在大小為49.5 KDa，44.8 KDa，39 KDa和29.9 KDa的地方出現(xiàn)了較為明顯的特異性蛋白條帶，與脫硫酶基因DszA、DszC、DszB和CysH所翻譯的蛋白大小相符。對(duì)重組菌株L-D中CysH所翻譯的APS還原酶進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，APS還原酶的最適溫度30℃，最適pH為6。另外，以DBT為底物發(fā)現(xiàn)工程菌

6、L-D所表達(dá)脫有機(jī)硫酶可降解DBT，說(shuō)明脫有機(jī)硫酶正確表達(dá)。
　　4、重組復(fù)合脫硫酶基因工程菌L-D對(duì)原煤脫硫的研究：考察反應(yīng)溫度、轉(zhuǎn)速、pH、反應(yīng)時(shí)間、煤粒度、煤漿濃度和接種量各因素對(duì)工程菌L-D脫硫的影響，綜合考慮，從脫硫率和脫硫的經(jīng)濟(jì)利益綜合考慮，確定了實(shí)驗(yàn)室條件下工程菌L-D脫硫的最佳條件：搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH6，煤漿濃度6.0%，脫硫時(shí)間6 d，接種量為10%，在最佳條件下，工程菌L