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1、江南大學(xué)博士學(xué)位論文嗜熱單孢菌角質(zhì)酶的基因鑒定、高效表達(dá)及分子改造姓名:陳晟申請學(xué)位級別:博士專業(yè):發(fā)酵工程指導(dǎo)教師:陳堅20090601摘要從周質(zhì)空間向培養(yǎng)基中分泌。研究表明,在對數(shù)生長中期,添加100mM甘氨酸、1mM表面活性劑TDOC均可將酶活最高點從80h提前至54h;采取重組大腸桿菌在25oC發(fā)酵至24h時將培養(yǎng)溫度提高至37oC的變溫策略對重組蛋白的分泌有促進(jìn)作用,酶活最高點出現(xiàn)于62h,比不變溫的對照提前了18h。4重組T
2、fu0882、Tfu0883和Esolanipisi角質(zhì)酶在水溶液中均以單體形式存在。重組Tfu0882、Tfu0883的最適溫度為60oC,并具有良好的熱穩(wěn)定性;重組Fsolanipisi角質(zhì)酶的最適溫度為40oC,熱穩(wěn)定性較差。三種角質(zhì)酶的最適pH均為80,pH穩(wěn)定范圍為609。0。三種角質(zhì)酶均能夠水解可溶性酯、不溶性甘油三酯和聚酯,并傾向于水解短鏈底物,沒有位置特異性。Esolanipisi角質(zhì)酶對州PB底物的親和力最大,催化效率
3、最高;Esolanipisi角質(zhì)酶水解PET能力最強(qiáng),Tfu0883次之,Tfu0882對PET僅有微弱水解。三種角質(zhì)酶都沒有界面活化現(xiàn)象,不需要二價金屬離子作為輔助因子,Mn2對三者有激活作用,CP和H92對三種角質(zhì)酶有強(qiáng)烈抑制作用。TritonX100和Tween20抑制Tfu0882和Tfu0883的活性,對Esolanipisi角質(zhì)酶無明顯作用;SDS對三種角質(zhì)酶均有競爭性抑制,Tfu0882抑制最弱;TDOC對Fsolanip
4、isi角質(zhì)酶有明顯激活作用。重組Tfu0882和Tfu0883在甲醇、乙醇等多種有機(jī)溶劑中具有良好的穩(wěn)定性,Esolanipisi角質(zhì)酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性較差。5以Streptomycesexfoliates脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)為模板,通過SWISSMODEL軟件模擬得到Tfu0883和Tfu0882結(jié)構(gòu)模型。模型顯示,Zfusca角質(zhì)酶具有典型的彰B水解酶結(jié)構(gòu),Tfu0883的活性中心由S170H248D216催化三角組成,Tfu0882
5、的活性中心由S188H266D234催化三角組成。Zfusca角質(zhì)酶活性中心上方?jīng)]有蓋子結(jié)構(gòu),活性中心暴露于溶劑中。角質(zhì)酶基因Flu0882和m0883在基因組中處在相鄰位置,并處于兩個不同的操縱子中,受到不同的調(diào)控。Tfu0882和Tfu0883在水解角質(zhì)過程中沒有協(xié)同作用。在結(jié)構(gòu)模擬的基礎(chǔ)上進(jìn)行理性分析,并成功構(gòu)建了角質(zhì)酶突變體Tfu08831218A、Tfu0883W195A/F249A和Tfu0883Q132A/T101A,催化
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