蘇云金芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)研究.pdf

1、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(vegetative。insecticidal proteins，VIPs)是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期分泌的一類新型殺蟲(chóng)毒蛋白。通過(guò)改造微生物來(lái)源的新型高毒力營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白VIP基因的核苷酸序列，優(yōu)化植物喜好密碼子，可以提高該基因在植物中的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。 本實(shí)驗(yàn)利用中國(guó)科學(xué)院微生物研究所改造的VIP基因構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438v，VIP基因的表達(dá)由

2、組成型的35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，胭脂堿合成酶基因的NOS終止子終止。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)抗性篩選、再生芽伸長(zhǎng)、生根等組織培養(yǎng)，獲得100多棵抗性轉(zhuǎn)基因再生植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草再生植株進(jìn)行分子檢測(cè)，轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性率為79.3％。為了確定外源基因的插入，從中選出6棵陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步進(jìn)行PCR.Southern雜交檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株與陽(yáng)性對(duì)照一樣有特異性條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隂](méi)有這條特異性條帶

3、。雖然PCR-Southern雜交不能反映外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的拷貝數(shù)，但通過(guò)特異條帶的有無(wú)可以證明VIP基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到煙草基因組DNA上。 對(duì)26株P(guān)CR陽(yáng)性植株進(jìn)行抗斜紋夜蛾活性檢測(cè)，以未轉(zhuǎn)基因煙草葉片作為對(duì)照。飼喂轉(zhuǎn)基因煙草葉片5d后，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的平均矯正死亡率為88.5％，而未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株對(duì)斜紋夜蛾則不表現(xiàn)抗性。其中的兩個(gè)株系vt和tvt分別為66.7％和87.5％。而其它四個(gè)株系均為100％0這可能是由于外源基

4、因在植物體內(nèi)表達(dá)差異引起的。通過(guò)Northem blot和Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證外源基因在再生植株中的表達(dá)情況。其中Northem blot結(jié)果表明6個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中有5個(gè)得以表達(dá)，Vt株系沒(méi)檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)，tvt信號(hào)比較弱。而Western blot檢測(cè)結(jié)果也同樣顯示，vt株系沒(méi)有特異性蛋白帶出現(xiàn)，其它5個(gè)株系蛋白均得到特異表達(dá)，但是表達(dá)量不同。 分子生物學(xué)檢測(cè)和對(duì)斜紋夜蛾的抗蟲(chóng)性檢測(cè)結(jié)果，都表明在轉(zhuǎn)基因煙草中，蘇云