蘇云金芽孢桿菌兩類殺蟲(chóng)蛋白的遺傳改良和抗蟲(chóng)性評(píng)價(jià).pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)在產(chǎn)胞期間可以分泌一種伴胞晶體蛋白(ICP)，對(duì)鱗翅目鞘翅目等昆蟲(chóng)（比如小菜蛾）有很強(qiáng)的殺傷作用，目前已被深入研究和廣泛使用，土豆、棉花等轉(zhuǎn)Bt基因作物已得到大規(guī)模商業(yè)化種植。但是，長(zhǎng)期單一使用ICP類殺蟲(chóng)蛋白有可能導(dǎo)致靶標(biāo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性或者交叉抗性。蘇云金芽胞桿菌在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期間，還會(huì)分泌一種與ICPs無(wú)氨基酸序列同源性、殺蟲(chóng)機(jī)理完全不同的蛋白，即營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(

2、vegetativeinsecticidal proteins，VIPs)，對(duì)一些對(duì)ICPs不敏感的害蟲(chóng)也有殺蟲(chóng)活性，并且不會(huì)發(fā)生交叉抗性。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道過(guò)的對(duì)不同害蟲(chóng)有著抗性的vip基因，對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)域與功能域進(jìn)行相互組合拼接，并根據(jù)植物密碼子偏好作了一定改造，共設(shè)計(jì)合成了14個(gè)vip新基因，旨在改造出能抗螟蟲(chóng)的新型vip基因資源，為開(kāi)發(fā)新型的水稻抗蟲(chóng)基因、避免靶標(biāo)昆蟲(chóng)產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性或者交叉抗性提供技術(shù)基礎(chǔ)。另外，對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)抗蟲(chóng)效果良

3、好的Bt基因做了一定的修飾并命名為mBt，希望能夠獲得毒性更強(qiáng)、殺蟲(chóng)效果更好的抗蟲(chóng)資源。
　　 將人工合成好的14個(gè)vip基因連入表達(dá)載體pSB130actin-nos，mBt基因則連入表達(dá)載體pSB130。兩個(gè)表達(dá)載體驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為水稻肌動(dòng)蛋白actinI啟動(dòng)子，終止子則為人工合成的nosT。連入目的基因后表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將攜帶有目的基因的T-DNA區(qū)整合到水稻染色體基因組中，經(jīng)PCR分子檢測(cè)后獲得了轉(zhuǎn)不同基因

4、的材料。將得到的轉(zhuǎn)vip基因材料分三套分別種植于浙江大學(xué)網(wǎng)室、浙江大學(xué)長(zhǎng)興基地、武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。在稻縱卷葉螟、二化螟發(fā)蟲(chóng)期間對(duì)這三個(gè)地點(diǎn)的材料分別進(jìn)行了蟲(chóng)害調(diào)查，并且對(duì)種植于華農(nóng)的材料進(jìn)行了室內(nèi)接蟲(chóng)鑒定（二化螟），最后根據(jù)田間調(diào)查得到的數(shù)據(jù)并結(jié)合華農(nóng)實(shí)驗(yàn)室兩次室內(nèi)接蟲(chóng)鑒的數(shù)據(jù)，初步認(rèn)定有2個(gè)vip基因（5號(hào)，6號(hào)）對(duì)螟蟲(chóng)存在著不同程度的抗性。轉(zhuǎn)mBt材料通過(guò)室內(nèi)接蟲(chóng)鑒定發(fā)現(xiàn)其對(duì)螟蟲(chóng)有著較強(qiáng)的抗性，高于修飾之前的Bt基因，田間調(diào)