蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定及殺蟲(chóng)基因的克隆.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種可以形成芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌，目前已成為產(chǎn)量最大、應(yīng)用面積最廣的微生物殺蟲(chóng)劑。隨著B(niǎo)t制劑的深入應(yīng)用，出現(xiàn)了害蟲(chóng)抗性及殺蟲(chóng)圖譜窄等問(wèn)題，因此篩選新的Bt基因和發(fā)掘已知基因的新活性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本研究從河北省五岳寨地區(qū)采集了756份土壤樣品，采集對(duì)象為地表以下5公分的腐殖土，通過(guò)溫度篩選法分離得到72株Bt菌株。光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)菌株的晶體形態(tài)發(fā)現(xiàn)伴

2、孢晶體包括了圓形、菱形、橢圓形、方形、不規(guī)則形等多種形態(tài)，充分體現(xiàn)五岳寨地區(qū)蘇云金芽孢桿菌資源豐富并具有良好的多態(tài)性。
　　 通過(guò)PCR-RFLP鑒定體系對(duì)分離得到的72株菌株進(jìn)行鑒定，利用26對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定基因型。結(jié)果表明，從這些菌株中發(fā)現(xiàn)13種不同的基因型和9種基因組合，其中基因型包括cry1類，cry2類，cry3類，cry4類，cry6類，cry8類，cry9類，cry11I類，cry18類，cry22類，

3、cry26類，cry32類和cry11類，其中所占比例最大的是含有cry8類基因的菌株，為38株，其次為含cry1類和cry2類基因型的菌株，分別為30株和14株，另有10株未鑒定出基因型，可能含有新基因，需要借助其他方法進(jìn)一步確定。
　　 SDS-PAGE蛋白分析結(jié)果表明，大部分菌株均會(huì)表達(dá)130kDa、90kDa、60kDa大小的蛋白。其中含有cry1+cry2基因組合的菌株大多表達(dá)130kDa和60kDa大小的蛋白，僅包含

4、cry1或cry2類基因的菌株大多只表達(dá)130kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)多為菱形;僅包含cry8類基因的菌株多數(shù)只表達(dá)130kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)多為圓形或橢圓形;同時(shí)含有cry3+cry8類基因組合的菌會(huì)表達(dá)130kDa大小的蛋白;含有cry22類基因的菌株表達(dá)約90kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)為圓形;而未鑒定出基因類型的菌株其蛋白大小表達(dá)多樣。
　　 在對(duì)榆蘭葉甲幼蟲(chóng)的生物活性測(cè)定中，菌株WYZ-54表現(xiàn)出了較強(qiáng)的活

5、性，其4d的校正死亡率達(dá)到80％，但是只表現(xiàn)出cry1、cry2和cry1I三類基因型，并未出現(xiàn)對(duì)鞘翅目具有活性的cry3或cry8類基因，通過(guò)克隆得到1500bp左右的部分基因序列，通過(guò)NCBIBlast分析，與GenBank中已知的Bt基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示菌株WYZ-54克隆的部分基因序列與GenBank中的已知模式基因Cry1Ia-likeprotein(cry1Ia)gene（序列號(hào):FJ617448.1）的相似性最高，為

6、99％。
　　 FPT-25為實(shí)驗(yàn)室保留菌株，在對(duì)暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)的生物活性測(cè)定中表現(xiàn)出較高活性，其14天校正死亡率達(dá)70％。經(jīng)PCR鑒定但未能確定其基因型，通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)80kDa和50kDa兩條條帶的蛋白，而并未表達(dá)一般對(duì)鞘翅目昆蟲(chóng)具有活性的130kDa的蛋白。根據(jù)Beron的研究方法，使用3對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收得到1900bp左右的基因片段，通過(guò)序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)與GenBank中已知的

7、Bt基因存在相似性，推測(cè)含有新型基因，有待進(jìn)一步研究。
　　 對(duì)72株Bt菌株的生物活性測(cè)定選取小菜蛾、斜紋夜蛾、華北大黑鰓金龜和銅綠麗金龜幼蟲(chóng)四種供試?yán)ハx(chóng)。結(jié)果顯示，對(duì)小菜蛾具有較高毒力的Bt菌株(4d校正死亡率≥90％)有11株，其中校正死亡率達(dá)到100％有9株;對(duì)斜紋夜蛾具有較高毒力的Bt菌株（4d校正死亡率≥90％）有13株，其中校正死亡率達(dá)到100％的有12株;有7株菌株對(duì)銅綠麗金龜幼蟲(chóng)具有較高殺蟲(chóng)活性（14d校正死亡