三孢布拉氏霉菌產(chǎn)類胡蘿卜素發(fā)酵調(diào)控機(jī)理的研究.pdf

1、三孢布拉氏霉菌是目前唯一實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的高產(chǎn)菌株。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素具有成本低、不受季節(jié)的限制、產(chǎn)品純度高和無毒副作用等優(yōu)勢(shì)。前人的研究結(jié)果表明，外源添加植物油能提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量，而且富含亞油酸和亞麻酸的植物油效果更顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明與葵花籽油和大豆油相比，亞麻籽油對(duì)提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量具有更顯著的效果。但是亞麻籽油是如何促進(jìn)三孢布拉氏霉菌產(chǎn)類胡蘿卜素的機(jī)理不明。而亞麻籽油富含α-亞麻酸(ALA)，因此，選擇了單

2、一成分ALA，從代謝和轉(zhuǎn)錄水平上來研究它如何促進(jìn)三孢布拉氏霉菌產(chǎn)類胡蘿卜素。
　　利用GC-MS技術(shù)及和多維數(shù)據(jù)分析技術(shù)相結(jié)合的方法，研究了ALA的添加引起的三孢布拉氏霉菌胞內(nèi)代謝物的變化。通過偏最小二乘判別分析法(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)分析，發(fā)現(xiàn)可以將對(duì)照組和ALA處理組區(qū)分開，并且使用了聚類分析進(jìn)一步驗(yàn)證了PLS-DA分析結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

3、，在外源ALA存在的條件下，菌體優(yōu)先利用外源的脂肪酸而不是從頭合成脂肪酸，這表現(xiàn)為處理組菌體胞內(nèi)亞麻酸和亞油酸的含量比對(duì)照組高很多，而他們的前體物質(zhì)的含量與對(duì)照相比并無差異。而脂肪酸和類胡蘿卜素的合成具有相同的前體物質(zhì)——乙酰輔酶A，這就使得更多的乙酰輔酶A用于類胡蘿卜素的合成。由于ALA的乳化作用，菌體形成了均勻分散的菌絲球，這樣有利于溶氧的增加，進(jìn)而促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時(shí)溶氧的增加也造成了氧化壓力的增加，因此菌體為了維

4、護(hù)自身的安全而合成更多的類胡蘿卜素，這是類胡蘿卜素合成的外界刺激因素之一。這一結(jié)論通過測(cè)定過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活力得到證實(shí)。
　　由于鑒定出的代謝物數(shù)量有限，再加上根據(jù)瞬時(shí)的物質(zhì)變化很難推斷代謝流的變化。因此，利用RNA-seq技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平上，全局的觀察基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)ALA添加后，脂肪酸合成的基因表達(dá)都顯著下調(diào)，脂肪酸降解的基因表達(dá)上調(diào)。還發(fā)現(xiàn)乙醛酸循環(huán)的兩個(gè)關(guān)鍵酶異檸檬酸裂合酶和檸檬酸合酶的基因表達(dá)上調(diào)，以及

5、糖異生途徑的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因表達(dá)也上調(diào)，而糖酵解途徑被抑制，這也解釋了為何代謝組學(xué)方法測(cè)定的ALA處理后胞內(nèi)葡萄糖含量積累。ALA的添加也使麥角固醇的合成減少。麥角固醇是類胡蘿卜素合成途徑的支路之一，也與類胡蘿卜素競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)入細(xì)胞膜，它的減少有利于類胡蘿卜素合成的增加。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)ALA顯著促進(jìn)八氫番茄紅素合成酶/番茄紅素環(huán)化酶(carRA)和八氫番茄紅素脫氫酶（carB）基因的表達(dá)，其次是促進(jìn)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因(c

6、arG)的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)了與類胡蘿卜素合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Mot3的轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)。Mot3是個(gè)多功能的調(diào)控因子，還具有抑制麥角固醇合成，抑制響應(yīng)性激素的基因的表達(dá)。Mot3在三孢布拉氏霉菌中的作用，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。一些轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)，表明ALA調(diào)控孢子的形成，菌絲及細(xì)胞壁的生成，細(xì)胞的分裂及性發(fā)育，如SteA。SteA是否也參與調(diào)控類胡蘿卜素的合成，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，還發(fā)現(xiàn)了對(duì)過氧化氫及其敏感的轉(zhuǎn)錄因子Pap1和Prr1的表達(dá)