拉曼光譜技術(shù)用于分析紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的研究.pdf

1、拉曼光譜是一種反映物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量信息的的分子振動光譜，主要是由分子對光的散射現(xiàn)象引起的，具有非破壞性、快速、實時分析的優(yōu)勢。近年來，拉曼光譜技術(shù)作為一種新興的光譜學分析方法，在物理、化學、材料科學以及生命科學等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價值。顯微拉曼光譜的空間分辨率較高，在分析樣品時將入射激光通過顯微鏡聚焦到樣品上，從而能在不受周圍其他物質(zhì)干擾的情況下精確獲得所照樣品微區(qū)的化學組成、分子結(jié)構(gòu)、分子取向以及分子相互作用等拉曼光譜信息。激光鑷子拉曼光譜

2、技術(shù)是將顯微拉曼光譜技術(shù)和激光光鑷相結(jié)合的一種光學技術(shù)，融合了光阱操控和拉曼光譜快速無損的優(yōu)勢，可長時間俘獲并固定處于溶液中的單細胞，從而在接近自然的生理條件下實時檢測和分析單細胞的生化動力學過程，也可監(jiān)測微生物產(chǎn)物的生成，為微生物發(fā)酵工業(yè)提供有效的檢測手段。
　　類胡蘿卜素是廣泛存在于生態(tài)系統(tǒng)中一大類色素，每年天然產(chǎn)量達數(shù)億噸。它們不僅賦予各種生物絢麗的色彩，并參與執(zhí)行光合作用過程中能量傳遞以及物質(zhì)轉(zhuǎn)化、猝滅單線態(tài)氧、抗光敏化作

3、用等生理功能，例如由于臭氧空洞所造成的紫外線對人類健康以及生態(tài)系統(tǒng)的威脅，類胡蘿卜素可起到一定的保護作用。另一方面，類胡蘿卜素作為重要的營養(yǎng)來源，具有預(yù)防腫瘤、癌癥，增強機體免疫功能以及保健的重要作用，在醫(yī)藥、食品、養(yǎng)殖和飼料等領(lǐng)域用途廣泛。
　　類胡蘿卜、素是C40類萜化合物，其化學性質(zhì)很不穩(wěn)定，對光、氧氣和酸極為敏感，這是類胡蘿卜素定量分析中遇到的主要問題，是分析過程必須注意的。傳統(tǒng)的分析方法中所必須的萃取過程在很大程度上影響

4、了檢測結(jié)果的準確性，相比之下，激光拉曼光譜法無需對樣品進行處理，可快速無損地獲得準確的檢測結(jié)果，是分析類胡蘿卜素的有效工具。
　　本文結(jié)合激光光鑷拉曼光譜技術(shù)、顯微拉曼光譜技術(shù)以及有關(guān)實驗設(shè)計方法開展了以下實驗工作:
　　1.建立一種利用顯微拉曼光譜原位定量篩選平板培養(yǎng)基上類胡蘿卜素高產(chǎn)突變株的方法。為了消除培養(yǎng)基背景信號對定量結(jié)果的影響，采用矢量校正算法對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，得到了不含培養(yǎng)基背景干擾的菌落凈信號;并比較了不

5、同光譜收集方式對光譜重現(xiàn)性的影響，發(fā)現(xiàn)掃描方式較定點檢測能獲得重現(xiàn)性更好、覆蓋大部分菌落信息的光譜信號;利用共焦顯微拉曼光譜法分析平板培養(yǎng)基上紅酵母菌落中的類胡蘿卜素，并用光鑷拉曼光譜法測定同一菌落內(nèi)紅酵母單細胞類胡蘿卜素含量進行驗證，發(fā)現(xiàn)兩種方法所得類胡蘿卜素1512cm-1拉曼峰高呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2達0.9395，說明共焦顯微拉曼光譜技術(shù)定量檢測平板培養(yǎng)基上菌落內(nèi)類胡蘿卜素的可行性;然后，再用該方法對紅酵母誘變菌進行篩

6、選，最終篩選出了兩株類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株。以上結(jié)果表明本文所建立的基于定量的菌種篩選方法較之傳統(tǒng)的基于目測的篩選方法更客觀、高效。
　　2.利用激光鑷子拉曼光譜技術(shù)(LTRS)測定紅酵母細胞中類胡蘿卜素的含量。采用Plackett-Burman法對影響紅酵母發(fā)酵的相關(guān)因素進行評價，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蛋白胨、pH和溫度對類胡蘿卜素的產(chǎn)量影響顯著。利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面分析法對影響類胡蘿卜素產(chǎn)量的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)發(fā)