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文檔簡介
1、核酸在細胞的生長、發(fā)育及分化過程中起著關鍵的作用。長期以來,核酸微陣列芯片技術作為核酸檢測的重要手段,在高通量核酸分析領域發(fā)揮著巨大的作用。微陣列芯片利用經(jīng)過特殊化學修飾的寡核苷酸探針,可以在一次反應中同時進行數(shù)百個基因位點的檢測。但是,核酸微陣列芯片的靈敏度低,無法滿足低含量核酸的檢測需求。PCR技術,作為一種在體外對核酸分子進行擴增的技術,具有靈敏度高、準確率好以及反應高效等特點,成為應用最為廣泛的一種低含量核酸檢測手段。多重PCR
2、是一種特殊形式的PCR,可在單次反應中進行多個目的核酸片段同步擴增,在基礎科研和臨床研究方面已經(jīng)有著廣泛的應用。傳統(tǒng)的多重PCR是在單個反應管中加入多對引物進行多個目的基因的并行擴增。這種方法具有一些局限性,主要表現(xiàn)在不同引物對之間的干擾和競爭使得各個目的基因較難均衡、有效地擴增,使得一次反應最多只能對10多重目的基因進行檢測。
近些年來,微液滴操控技術得到快速的發(fā)展,并且已經(jīng)出現(xiàn)了多種形式的微液滴技術平臺。相比于傳統(tǒng)的試管反
3、應體系,微液滴反應體系具有許多獨特的優(yōu)勢。首先,液滴的體積可小至納升級或皮升級,反應的試劑消耗量可降低3個數(shù)量級以上,大幅度減少實驗成本。其次,液滴之間被與之不互溶的另一相所間隔,每個液滴皆可作為獨立的微反應器,可以同時對多個樣品進行高通量平行分析。第三,微反應器內(nèi)液體混合速度快,熱傳遞效率高,能夠實現(xiàn)快速的生化反應,大幅減少反應時間,提高反應效率。第四,微反應器的尺寸與細胞體積相當,適合進行單細胞捕獲及操控,可實現(xiàn)單細胞的檢測分析。第
4、五,微型化反應器有助于將樣品純化、混合、擴增、檢測等一系列操作整合到一起,使系統(tǒng)更易實現(xiàn)自動化、便攜化。目前,微液滴技術已經(jīng)廣泛應用于蛋白質檢測、酶動力學反應、PCR反應、單細胞研究等生物學檢測技術中,在生命科學研究領域展現(xiàn)出強大的應用潛力。
本論文研究的內(nèi)容包括:
1、基于親疏水模式的微液滴陣列芯片的制備
本論文發(fā)展了一種極其簡單的方法來制作基于親疏水模式的微液滴陣列芯片。首先通過點樣的方式將含有親水性物
5、質的溶液點樣至疏水性平整表面以形成微小的液滴陣列,而后將液滴干燥以除去微小液滴中的水分,使液滴中的親水性物質與疏水性平整表面相結合,形成親水性樣點陣列。之后將含有反應物的溶液點樣至親水性樣點處,并在其上覆蓋一層與水不互溶的油相物質,從而在各親水結合點處形成獨立的微小反應液滴。最后在設定的反應條件下,各微小反應液滴中的物質發(fā)生特定的生化反應。該方法克服了現(xiàn)有的微液滴芯片制作成本高、操作復雜、設備昂貴等問題,使多重并行反應處理系統(tǒng)能在普通實
6、驗條件下實施,極大地擴展了其應用范圍。
2、基于微液滴陣列芯片的多重PCR系統(tǒng)
本論文將基于親疏水模式的微液滴陣列芯片與PCR技術相結合,在不同的親水樣點處預置特異的引物,建立了一種中等通量的多重核酸檢測系統(tǒng)。通過對PCR過程中的熒光信號進行實時監(jiān)測,實現(xiàn)了多重基因的并行定量分析。利用該系統(tǒng),在單張標準載玻片上,可以同時發(fā)生至少96個PCR反應。該系統(tǒng)的試劑消耗量極低,每個液滴的體積為500nl,僅相當于常規(guī)PCR實
7、驗的四十分之一。PCR擴增的檢測線性范圍超過5個數(shù)量級。單個液滴的PCR擴增靈敏度低至1個分子,可進行數(shù)字PCR系統(tǒng)的開發(fā)研究。采用該系統(tǒng)進行多重PCR檢測,結果準確,且具有高度特異性。此外,該系統(tǒng)作為一種通用化的實時定量PCR平臺,不僅可用于多重DNA的分析,還可用于RNA的定量檢測,在定量生物學中具有廣泛的應用前景。
3、基于恒溫擴增的多重核酸檢測技術
本論文將親疏水模式的微液滴陣列芯片與滾環(huán)擴增技術相結合,建立
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