基于親疏水模式的微液滴陣列芯片及其在多重核酸檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、核酸在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育及分化過程中起著關(guān)鍵的作用。長(zhǎng)期以來，核酸微陣列芯片技術(shù)作為核酸檢測(cè)的重要手段，在高通量核酸分析領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用。微陣列芯片利用經(jīng)過特殊化學(xué)修飾的寡核苷酸探針，可以在一次反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行數(shù)百個(gè)基因位點(diǎn)的檢測(cè)。但是，核酸微陣列芯片的靈敏度低，無法滿足低含量核酸的檢測(cè)需求。PCR技術(shù)，作為一種在體外對(duì)核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確率好以及反應(yīng)高效等特點(diǎn)，成為應(yīng)用最為廣泛的一種低含量核酸檢測(cè)手段。多重PCR

2、是一種特殊形式的PCR，可在單次反應(yīng)中進(jìn)行多個(gè)目的核酸片段同步擴(kuò)增，在基礎(chǔ)科研和臨床研究方面已經(jīng)有著廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的多重PCR是在單個(gè)反應(yīng)管中加入多對(duì)引物進(jìn)行多個(gè)目的基因的并行擴(kuò)增。這種方法具有一些局限性，主要表現(xiàn)在不同引物對(duì)之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)使得各個(gè)目的基因較難均衡、有效地?cái)U(kuò)增，使得一次反應(yīng)最多只能對(duì)10多重目的基因進(jìn)行檢測(cè)。
　　近些年來，微液滴操控技術(shù)得到快速的發(fā)展，并且已經(jīng)出現(xiàn)了多種形式的微液滴技術(shù)平臺(tái)。相比于傳統(tǒng)的試管反

3、應(yīng)體系，微液滴反應(yīng)體系具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，液滴的體積可小至納升級(jí)或皮升級(jí)，反應(yīng)的試劑消耗量可降低3個(gè)數(shù)量級(jí)以上，大幅度減少實(shí)驗(yàn)成本。其次，液滴之間被與之不互溶的另一相所間隔，每個(gè)液滴皆可作為獨(dú)立的微反應(yīng)器，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行高通量平行分析。第三，微反應(yīng)器內(nèi)液體混合速度快，熱傳遞效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)快速的生化反應(yīng)，大幅減少反應(yīng)時(shí)間，提高反應(yīng)效率。第四，微反應(yīng)器的尺寸與細(xì)胞體積相當(dāng)，適合進(jìn)行單細(xì)胞捕獲及操控，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的檢測(cè)分析。第

4、五，微型化反應(yīng)器有助于將樣品純化、混合、擴(kuò)增、檢測(cè)等一系列操作整合到一起，使系統(tǒng)更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、便攜化。目前，微液滴技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)、酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、PCR反應(yīng)、單細(xì)胞研究等生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)中，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。
　　本論文研究的內(nèi)容包括:
　　1、基于親疏水模式的微液滴陣列芯片的制備
　　本論文發(fā)展了一種極其簡(jiǎn)單的方法來制作基于親疏水模式的微液滴陣列芯片。首先通過點(diǎn)樣的方式將含有親水性物

5、質(zhì)的溶液點(diǎn)樣至疏水性平整表面以形成微小的液滴陣列，而后將液滴干燥以除去微小液滴中的水分，使液滴中的親水性物質(zhì)與疏水性平整表面相結(jié)合，形成親水性樣點(diǎn)陣列。之后將含有反應(yīng)物的溶液點(diǎn)樣至親水性樣點(diǎn)處，并在其上覆蓋一層與水不互溶的油相物質(zhì)，從而在各親水結(jié)合點(diǎn)處形成獨(dú)立的微小反應(yīng)液滴。最后在設(shè)定的反應(yīng)條件下，各微小反應(yīng)液滴中的物質(zhì)發(fā)生特定的生化反應(yīng)。該方法克服了現(xiàn)有的微液滴芯片制作成本高、操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴等問題，使多重并行反應(yīng)處理系統(tǒng)能在普通實(shí)

6、驗(yàn)條件下實(shí)施，極大地?cái)U(kuò)展了其應(yīng)用范圍。
　　2、基于微液滴陣列芯片的多重PCR系統(tǒng)
　　本論文將基于親疏水模式的微液滴陣列芯片與PCR技術(shù)相結(jié)合，在不同的親水樣點(diǎn)處預(yù)置特異的引物，建立了一種中等通量的多重核酸檢測(cè)系統(tǒng)。通過對(duì)PCR過程中的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了多重基因的并行定量分析。利用該系統(tǒng)，在單張標(biāo)準(zhǔn)載玻片上，可以同時(shí)發(fā)生至少96個(gè)PCR反應(yīng)。該系統(tǒng)的試劑消耗量極低，每個(gè)液滴的體積為500nl，僅相當(dāng)于常規(guī)PCR實(shí)

7、驗(yàn)的四十分之一。PCR擴(kuò)增的檢測(cè)線性范圍超過5個(gè)數(shù)量級(jí)。單個(gè)液滴的PCR擴(kuò)增靈敏度低至1個(gè)分子，可進(jìn)行數(shù)字PCR系統(tǒng)的開發(fā)研究。采用該系統(tǒng)進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確，且具有高度特異性。此外，該系統(tǒng)作為一種通用化的實(shí)時(shí)定量PCR平臺(tái)，不僅可用于多重DNA的分析，還可用于RNA的定量檢測(cè)，在定量生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　3、基于恒溫?cái)U(kuò)增的多重核酸檢測(cè)技術(shù)
　　本論文將親疏水模式的微液滴陣列芯片與滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，建立