一維微流控微珠陣列芯片在核酸和蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用.pdf

1、作為一種新型的化學(xué)生物微分析技術(shù)平臺，一維微流控微珠陣列芯片(簡稱一維芯片)結(jié)合了微流控芯片技術(shù)、微陣列芯片技術(shù)和微珠非均相識別技術(shù)的優(yōu)點。在蛋白質(zhì)表達(dá)以及核酸檢測中的初步應(yīng)用證實了該技術(shù)平臺在生物研究領(lǐng)域的獨特優(yōu)勢。為了拓展一維芯片的應(yīng)用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善和提高該芯片在核酸和蛋白質(zhì)分析中的性能，使其發(fā)展成為一種有實用價值的、高靈敏的核酸與蛋白質(zhì)分析平臺，本文開展了以下幾個方面的工作。 首先，拓展了一維芯片的應(yīng)用，將其用于

2、疾病相關(guān)基因以及病毒基因的分析，具體包括以下三個部分： (1)發(fā)展了一種基于三明治雜交檢測原理的多基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)一維芯片。根據(jù)GenBank中p53、H-ras和NME1三種基因mRNA序列分別設(shè)計并合成了三種三明治探針。將捕獲探針修飾在二氧化硅微珠表面，采用顯微操作系統(tǒng)轉(zhuǎn)移功能化的微珠至微通道小室中，構(gòu)成一維捕獲探針微珠陣列。首先考察了基于三明治雜交法的芯片內(nèi)DNA合成樣品的雜交、檢測性能，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了DNA混合樣品中多

3、個目標(biāo)分子的同時檢測，進(jìn)而對細(xì)胞提取樣品中多個目標(biāo)基因的mRNA．表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。該一維微流控核酸微珠陣列對目標(biāo)DNA樣品的檢測靈敏度為0.02 nM，線性響應(yīng)范圍為0.02.1.0 nM，無需對目標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記即可實現(xiàn)多目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)檢測。 (2)一維芯片在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)研究中的應(yīng)用。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤病人死亡的主要因素，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。在第一部分工作的基礎(chǔ)上，將一維芯片成功地應(yīng)用于具有不同轉(zhuǎn)移

4、潛能的腫瘤細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)差異研究。選擇與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的三個基因：E-cadherin、mts1和NME1為研究對象，以結(jié)腸腺癌原發(fā)癌細(xì)胞株SW480和轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株LoVo以及前列腺癌不轉(zhuǎn)移細(xì)胞株：PC-3M-284和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)C-3M-1E8為研究模型，實現(xiàn)了兩組具有不同轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)譜差異分析。實驗結(jié)果表明，一維芯片在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)研究中的應(yīng)用對腫瘤的早期診斷、預(yù)測和治療有重要價值

5、。 (3)一維芯片在乙型肝炎病毒基因分型中的應(yīng)用。不同基因型的乙型肝炎病毒(HBV)之間存在致病性上的差異，同時病毒基因變異可引起抗藥性不同的后果，在臨床上會表現(xiàn)為漏診，盲目用藥和延誤治療。以中國地區(qū)最為常見的B、C、D三種HBV基因型為研究對象，根據(jù)GenBank中發(fā)表的三種基因型HBV病毒株基因序列，設(shè)計合成B、C、D三種基因型特異的基因分型三明治探針，構(gòu)建了B、C、D基因分型一維芯片。通過摸索和優(yōu)化雜交、洗脫等實驗條件，利

6、用一維芯片平臺實現(xiàn)了乙型肝炎病毒B、C、D三種基因型目標(biāo)DNA序列的準(zhǔn)確分型。該HBV基因分型方法簡單、快速、準(zhǔn)確性高，有望應(yīng)用于臨床HBV基因診斷，為病人的治療提供幫助。其次，為進(jìn)一步提高該芯片平臺的性能，發(fā)展了基于一維芯片的核酸和蛋白質(zhì)高靈敏分析方法： (4)發(fā)展了一種高靈敏的原位信號放大核酸分析新方法。結(jié)合金納米顆粒與聚合酶催化熒光標(biāo)記的雙重信號放大技術(shù)，實現(xiàn)基于一維芯片的高靈敏的核酸分析。該方法對DNA樣品的檢測下限可達(dá)

7、7.0 fM，最低可檢測到140個CNE2細(xì)胞/μl樣品中的p53 mRNA。與前面幾部分工作相比，本方法靈敏度提高了3個數(shù)量級，而且這種原位信號放大技術(shù)適合于在微流控芯片中進(jìn)行多目標(biāo)同時檢測。這種基于一維芯片的高靈敏核酸分析技術(shù)是對該平臺的進(jìn)一步完善和提高，使其在核酸分析領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。 (5)發(fā)展了一種基于端粒酶信號放大的高靈敏蛋白質(zhì)檢測方法。在本實驗室發(fā)展的一維蛋白質(zhì)微珠陣列用于蛋白質(zhì)表達(dá)分析工作的基礎(chǔ)上，發(fā)展了

8、一種通過核酸信號放大技術(shù)實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的高靈敏檢測分析方法。利用端粒酶可通過自身RNA模板不斷將TTAGGG重復(fù)序列添加至端粒酶引物末端的特性，在液相中合成生物素標(biāo)記的熒光探針，通過生物素-親和素-生物素交聯(lián)將熒光探針與生物素標(biāo)記的一抗結(jié)合，實現(xiàn)對目標(biāo)抗原的高靈敏檢測。該方法對p53蛋白的檢測下限可達(dá)1.0 pM，比一維微珠陣列內(nèi)雙抗體夾心免疫分析法靈敏度提高了近2個數(shù)量級，最低可檢測到85個CNE2細(xì)胞/μl樣品中的p53蛋白。利用該方

9、法實現(xiàn)了CNE2細(xì)胞和5-Fu處理的CNE2細(xì)胞中p53、c-myc、β-actin三種基因的表達(dá)差異分析。與免疫PCR和免疫RCA技術(shù)相比，本方法簡單、快速，可進(jìn)行高通量平行分析。該方法在一維蛋白質(zhì)芯片中的應(yīng)用提高了該蛋白分析平臺的靈敏度，對實現(xiàn)基于該平臺的低豐度多蛋白檢測具有重要意義。 最后，對一維芯片的流體驅(qū)動和控制系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)： (6)設(shè)計制作了集成微驅(qū)動泵的一維芯片。針對一維芯片采用壓力、電滲流或重力進(jìn)行流體