DNA分子機(jī)器在核酸放大檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、DNA分子機(jī)器在核酸放大檢測中的應(yīng)用研究學(xué)位論文完成日期：指導(dǎo)教師簽字：2Q12生魚旦晝目絲墟答辯委員會成員簽字：之銘定》態(tài)硪與二蟄青島科技大學(xué)研究生學(xué)位論文DNA分子機(jī)器在核酸放大檢測中的應(yīng)用研究摘要光學(xué)分析法具有較高的靈敏度和選擇性，且具有方法簡單實用、操作方便、高效、快速等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關(guān)注。本文基于DNA分子機(jī)器建立了兩種核酸放大檢測的新方法——基于DNA輪烷結(jié)構(gòu)的交叉滾環(huán)復(fù)制放大方法和基于核酸外切酶的級聯(lián)循環(huán)放大方法，

2、采用光學(xué)分析法檢測，分別實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞中提取的信使RNA(mRNA)和免標(biāo)記DNA的高靈敏度、高選擇性測定，并將這兩種方法成功應(yīng)用于復(fù)雜樣品和血清樣品的分析。本文豐要開展了以下兩個方面的工作：一、基于DNA輪烷結(jié)構(gòu)的交叉滾環(huán)復(fù)制放大檢測腫瘤細(xì)胞中mRNA的研究建立了一種高靈敏度和高選擇性的免PCR檢測mRNA表達(dá)水平的新方法。首先，合成兩種DNA準(zhǔn)輪烷結(jié)構(gòu)(DPRI和DPR—II)，加入與Bactin0CTB)mRNA相對應(yīng)的靶cDN

3、A，DPR—I中的缺口環(huán)作為滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)的模板，在生物素修飾的引物、DNA酶和dNTPs的作用下，引發(fā)滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，取代釋放DNA，引發(fā)DPRI和DPR—II之間的交叉滾環(huán)復(fù)制過程。合成出滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物包含多個HRP模擬酶單元，可催化H202氧化ABTS。生成ABTS一?？紤]到在ABTS2。／H202紫外可見體系中hemin本身產(chǎn)生的高背景值，通過生物素一親和素的特異性識別，采用親和素包被的磁珠捕獲生物素化的滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物檢測cDNA的檢測

4、限可達(dá)01zmol，靈敏度與PCR方法相當(dāng)。將所建立的方法應(yīng)用j二乳腺癌細(xì)胞中ACTBmRNA的檢測，具有一定的臨床應(yīng)用價值。二、基于核酸外切酶級聯(lián)循環(huán)放大免標(biāo)記檢測DNA的研究采用三種無標(biāo)記頸環(huán)結(jié)構(gòu)DNA(MBl，MB2，MB，)，基于核酸外切酶lII(Exo。III)作用于雙鏈DNA，沿3’一5’方向逐步切去單核苷酸的性質(zhì)，通過靶DNA的引發(fā)，實現(xiàn)了基于核酸外切酶輔助的級聯(lián)循環(huán)放大(ExoCRA)免標(biāo)記檢測DNA。通過優(yōu)化實驗條件(