微囊藻毒素-RR對小鼠水代謝和神經(jīng)行為的影響及機制研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 微囊藻毒素-RR持續(xù)暴露導致小鼠水代謝異常機制研究
　　目的：探究微囊藻毒素-RR（MC-RR）連續(xù)染毒對小鼠水代謝的影響及主要作用機制。方法：第一階段：將28只6~7周齡SPF級雄性昆明小鼠隨機分為4組，連續(xù)腹腔注射MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)30天，每天記錄小鼠的體重、飲水量和尿量，30天后觀察小鼠肝臟、腎臟的損傷

2、情況，檢測肝組織血管緊張素原（AGT）基因的表達水平。第二階段：建立在第一階段的實驗基礎上。將56只6~7周齡SPF級雄性昆明小鼠隨機分為8組，每組7只。其中四組連續(xù)腹腔注射MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)30天后停止染毒，繼續(xù)觀察至42天，記錄小鼠每天的飲水量、尿量和體重變化，42天后檢測小鼠肝臟損傷情況以及體內(nèi)RAS水平；另外四組小鼠連續(xù)腹腔注射染毒至60天，每天觀察延長染

3、毒期間各組小鼠的飲水量、尿量和體重的變化，60天后檢測各染毒劑量組小鼠肝臟、腎臟的組織病理學變化、血清生化酶等指標。第三階段：將168只6~7周齡SPF級雄性昆明小鼠隨機分為4組，劑量同上，染毒28天，停藥后繼續(xù)觀察至42天，在此過程中將染毒第7、14、21、28、35和42天設置為取樣時間點，每組每次取樣量為n=7，檢測每個時間點各個染毒劑量組小鼠的組織病理學變化、臟器系數(shù)、尿比重、尿電解質(zhì)、尿微量白蛋白、血清生化酶、血清RAS水平、

4、血清AVP濃度等指標。第四階段：將28只6~7周齡SPF級雄性昆明小鼠隨機分為4組，用腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）阻斷劑阿利吉侖（aliskiren）和MC-RR聯(lián)合染毒驗證由前三個實驗階段結果得出的實驗結論，注射劑量分別為140μg/kg MC-RR、140μg/kg MC-RR+100mg/kg阿利吉侖、140μg/kg MC-RR+50mg/kg阿利吉侖、生理鹽水，連續(xù)腹腔注射30天，每天記錄各劑量組小鼠的飲水量和尿量，第30天對

5、小鼠體內(nèi)RAS水平進行檢測。
　　結果：（1）140μg/kg MC-RR劑量組在染毒第9天起飲水量和尿量增加，隨著染毒時間的積累，與對照組飲水和尿量的差別逐漸加大，在染毒第30天時高劑量組尿量約為對照組的5倍，飲水量約為2倍；染毒停止后，140μg/kg MC-RR劑量組小鼠尿量在一周內(nèi)恢復到對照組水平；60天延長染毒實驗中，140μg/kg組小鼠的飲水和尿量持續(xù)升高至30天，然后進入第一個平臺期（尿量為0.21~0.25ml/

6、g/day，飲水量為0.51~0.60ml/g/day），在染毒第43天時飲水和尿量再次升高，并進入第二個平臺期（尿量為0.25~0.32ml/g/day，飲水量為0.60~0.68ml/g/day），持續(xù)至染毒結束。（2）140μg/kg MC-RR劑量組小鼠體重增長明顯低于對照組，肝臟損傷明顯，主要表現(xiàn)為：與對照組比較，肝臟臟器系數(shù)值增大（P<0.05），組織病理學觀察可見肝細胞腫脹，炎性細胞浸潤，血清ALT、AST、ALP等酶學指

7、標呈時間依賴性升高，然而在整個實驗過程中未觀察到明顯的腎臟損傷：腎臟組織病理學觀察未見異常，BUN、CREA、UA、尿微量白蛋白（mALB）、尿電解質(zhì)等指標未見病理性異常變化。（3）140μg/kg MC-RR染毒組小鼠肝臟血管緊張素原（AGT）mRNA表達水平上調(diào)至對照組水平的1.5倍左右（P<0.05），同時血清RAS標志物濃度呈時間依賴性升高，并與肝臟損傷指標的變化趨勢相一致。血清AVP檢測值也增高。（4）停止染毒后，MC-RR引

8、起的多飲、多尿、增高的RAS標志物水平和肝臟損傷在一至兩周內(nèi)陸續(xù)恢復到對照組水平；100mg/kg劑量的RAS阻斷劑（阿利吉侖）可幾乎完全抑制140μg/kg MC-RR引起的多飲，多尿以及體內(nèi)增高的RAS標志物水平，在不同阻斷劑量下呈現(xiàn)典型劑量效應關系。
　　結論：在非致死較高劑量持續(xù)暴露下，MC-RR可以通過肝臟損傷引起昆明小鼠體內(nèi)RAS級聯(lián)水平升高，最終導致多飲、多尿等水代謝異常。
　　第二部分 微囊藻毒素-RR對小鼠

9、神經(jīng)行為的影響及機制初探
　　目的：實驗觀察微囊藻毒素-RR（MC-RR）重復染毒對小鼠神經(jīng)行為的影響，并初步探究可能的作用機制。
　　方法：28只6~7周齡SPF級雄性昆明小鼠隨機分為4組，連續(xù)腹腔注射染毒MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)7天，染毒3天開始水迷宮實驗訓練，第7天進行水迷宮實驗和曠場實驗。染毒結束后透射電鏡觀察實驗小鼠大腦皮層血腦屏障超微結構的改變，

10、免疫組化和液質(zhì)方法檢測染毒小鼠腦組織中MC-RR的積累，高效液相熒光方法檢測腦組織中四種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量，熒光定量法比較Oatp家族在小鼠腦組織和肝臟中基因的mRNA表達種類和表達量的差異。
　　結果：140μg/kg MC-RR染毒7天可致昆明雄鼠自發(fā)活動增強，但未觀察到對小鼠學習記憶的影響；140μg/kg MC-RR劑量組小鼠大腦皮層毛細血管內(nèi)皮細胞超微結構改變，表現(xiàn)出胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹；免疫組化分析結果可見小

11、鼠大腦皮層細胞中MC-RR的積累量隨著染毒劑量的提高逐漸增多，MMPB氧化還原-液質(zhì)檢測法在各劑量組均未檢測到MC-RR；高劑量MC-RR可引起腦組織中四種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量升高：谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，γ-氨基丁酸，分別達到7.79±2.40mg/kg，4.30±0.67mg/kg，2.30±0.67mg/kg，1.30±0.19mg/kg，且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而另外兩個劑量組與對照組比，腦組織中四種氨

12、基酸的含量雖有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；熒光定量PCR方法檢測到小鼠腦組織中Oatp1c1、Oatp3a1、Oatp1a4基因的mRNA表達水平較高，Oatp1a1、Oatp1b2、Oatp2b1、Oatp2a1、Oatp1a5這些在肝組織中mRNA表達水平較高的Oatps在腦組織中也有不同程度的表達。
　　結論：MC-RR可能通過Oatps轉運到小鼠大腦皮層，引起線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構的破壞，神經(jīng)遞質(zhì)的異常釋放，最