微囊藻毒素對HepG2細胞的毒性及其作用機制研究.pdf

1、水體富營養(yǎng)化導致藍藻水華的頻繁發(fā)生已成為國內外普遍關注的水環(huán)境污染問題。藍藻水華不僅污染水體、破壞飲用水源、造成漁業(yè)損失，而且多數(shù)藍藻水華還由于產生藍藻毒素（cyanotoxins）而影響和危害水生生物甚至人的健康。在眾多藍藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins，MCs)是分布最廣且毒性最強的一類環(huán)七肽肝毒素。目前已發(fā)現(xiàn)超過100種MCs異構物，它們具有廣譜的生物毒性，且化學性質穩(wěn)定，在自然水體中難以降解。因此，它們對人類健康的

2、影響尤其令人關注。近年來，關于MCs對動物或細胞的毒性及其作用機制的探索已成為MCs毒理學研究的重點和熱點。關于MCs的毒性作用及其機理研究雖然有很多新的發(fā)現(xiàn)和見解，但其作用的具體信號通路目前尚不完全清楚，而且存在一定的爭議，而該問題的解決是進行MCs環(huán)境和健康風險評價的基礎。
　　本研究選擇MCs異構體中最常見且毒性最大的微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)，以人肝癌細胞HepG2作為實驗模型，研究MC-

3、LR對HepG2細胞的毒性及其作用機制，以期進一步豐富和完善MC-LR肝細胞毒性作用機制理論、解析MC-LR毒性作用的危害及評價MC-LR的環(huán)境安全風險，為研究MCs對人類健康的影響及其防護提供理論支撐。
　　研究內容及獲得的主要實驗結果：
　　(1)MC-LR對HepG2細胞的毒性作用及其特點
　　本研究首先通過MTT實驗檢測細胞活力、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡、倒置熒光顯微鏡檢測細胞及細胞器形態(tài)，評價MC-LR對

4、HepG2細胞的毒性作用及其特點。實驗結果顯示，0.1 nM-10μM MC-LR短時間暴露未對HepG2細胞的活力、細胞周期和細胞凋亡產生明顯影響;而0.1-50 nM MC-LR處理HepG2細胞96 h也未顯著改變細胞活力。高濃度MC-LR(20-100μM)暴露HepG2細胞卻顯著抑制細胞活力，并呈時間-劑量-效應關系。用0.5-50μM MC-LR暴露HepG2細胞，倒置熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，高濃度MC-LR暴露改變HepG2細

5、胞形態(tài)、導致細胞損傷。Hoechst33342染色后檢測發(fā)現(xiàn)，一定濃度的MC-LR暴露導致細胞核損傷并誘導細胞凋亡。Acridmeorange染色后檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度MC-LR暴露對細胞溶酶體造成嚴重損傷，且呈時間-劑量依賴效應關系。Rhodamine-123染色檢測發(fā)現(xiàn)，較低濃度MC-LR暴露，部分HepG2細胞線粒體出現(xiàn)輕微形態(tài)改變，但無明顯結構損傷;而高濃度MC-LR長時間暴露后，HepG2細胞線粒體損傷明顯，且彌散性地分布在細胞內

6、，這說明MC-LR暴露對HepG2細胞的線粒體產生了損傷。
　　該實驗結果表明，MC-LR對HepG2細胞的毒性具有濃度依賴性，非細胞毒濃度染毒對細胞活力無影響，而高濃度處理可導致細胞凋亡。
　　(2)MC-LR對HepG2細胞代謝及其耐藥基因表達的影響
　　由于0.1 nM-10μM MC-LR暴露HepG2細胞24 h并未影響受試細胞的細胞活力、細胞周期和細胞凋亡。因此，我們首先要確定HepG2細胞內是否表達MC-

7、LR特異性轉運體—有機陰離子轉運多肽（OATP1B1和OATP1B3），并確定MC-LR是否真正進入到HepG2細胞內。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞內確實存在OATP1B1和OATP1B基因的表達。而通過Western blot技術并使用MC-LR特異性抗體檢測，結果證實MC-LR可進入HepG2細胞，且MC-LR處理濃度越高，檢測到細胞內MC-LR特異性條帶越強。MC-LR雖然可進入HepG2細胞，但低濃度染毒并未對細胞表型產

8、生影響。但進一步研究發(fā)現(xiàn)，MC-LR暴露引起HepG2細胞Ⅰ相和Ⅱ相部分代謝酶及外排泵基因表達的改變，說明MC-LR染毒可能擾亂這些代謝酶的正常功能。因此推測HepG2細胞代謝酶在MC-LR代謝和解毒過程中可能發(fā)揮作用。為了驗證該假設，接下來我們使用CYPs誘導劑Omeprazole(OME)、Ethanol(ETH)和Rifampicin(RIF)處理HepG2細胞，提高代謝酶活性以證實HepG2細胞內代謝酶是否在MC-LR的代謝過程

9、中發(fā)揮作用。實驗結果顯示，用5μM MC-LR染毒后，CYPs誘導劑影響HepG2細胞活力，其中ETH的誘導作用最明顯。由于ETH是CYP2E1特異性誘導劑，進一步通過CYP2E1抑制劑Chlormethiazole(CMZ)實驗證實，MC-LR可通過上調CYP2E1表達或酶活性而誘導產生過量的ROS，并對HepG2細胞產生毒性、引起線粒體損傷而導致細胞凋亡。通過ROS清除劑L-抗壞血酸與MC-LR共培養(yǎng)細胞，結果發(fā)現(xiàn)ROS清除劑能減少

10、MC-LR誘導產生ROS及其誘導的細胞死亡。
　　(3)MC-LR低濃度長期暴露對HepG2細胞的影響
　　已有研究表明，低濃度MC-LR長期暴露能促進細胞增殖并誘發(fā)肝炎/肝癌。為探究該機理，本研究進一步選擇低濃度MC-LR(0.1-30 nM)暴露HepG2細胞83 d。Western blot檢測結果顯示，即使極低濃度的MC-LR(0.1 nM)染毒后，該毒素也可有效地進入HepG2細胞，但CCK-8檢測并未發(fā)現(xiàn)MC-L

11、R對細胞活力產生明顯的影響。然而，通過DCF熒光分析結果顯示，30 nM MC-LR暴露HepG2細胞使其ROS水平較對照組顯著上升;而5和10 nM MC-LR長時間暴露促進細胞SOD活性升高。該結果說明，低濃度MC-LR長時間暴露也能誘導細胞產生過量的ROS，而細胞內高活性SOD可能在清除過量ROS過程中發(fā)揮重要作用。采用0.1-30 nM MC-LR暴露HepG2細胞48 h，對細胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL

12、-6的表達水平無明顯影響;而MC-LR長時間暴露卻顯著提升細胞內NF-κB p65、TNF-α、 IL-1β和IL-6的表達水平。
　　(4)高濃度MC-LR處理致HepG2細胞凋亡及其機理
　　細胞毒性實驗結果表明，高濃度MC-LR可通過誘導HepG2細胞產生過量的ROS而對細胞產生毒性并導致細胞凋亡。為探究MC-LR誘導HepG2細胞產生過量ROS導致細胞凋亡的信號途徑，我們用10-50μM MC-LR暴露HepG2細胞

13、，檢測后發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞內ROS水平上升、HSP70和HSP90表達增加、SOD和CAT活性降低、GSH含量降低，且較高濃度組與對照組差異顯著。另外，HepG2細胞MDA水平明顯提高。該結果說明，高濃度MC-LR暴露誘導HepG2細胞產生過量的ROS、引起細胞氧化應激，并導致細胞脂質過氧化程度加重。
　　用0.5-50μM MC-LR暴露HepG2細胞，通過Western blot和qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞線粒體相關的

14、COX-2、Cyt-c和Smac/Diablo的表達上調;p53 mRNA水平上調，并使其蛋白磷酸化水平明顯增強;p21/WAF1、Fas和FasL表達水平普遍上調。MC-LR暴露還影響HepG2細胞Bad、Cleaved-Bid、Bcl-2和Bax蛋白表達水平，促進Bax與Bcl-2表達。MC-LR暴露顯著促進HepG2細胞PUMA蛋白表達;而30和50μM MC-LR處理6h抑制細胞survivin表達，隨后多數(shù)濃度MC-LR處理組

15、卻促進survivin表達。另外，0.5-50μM MC-LR暴露還促進細胞Caspase-3和Caspase-9 mRNA水平提升和酶活性升高，而高濃度MC-LR暴露也促進Caspase-8的表達。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞c-myc mRNA變化與MC-LR暴露濃度和時間有關，且MC-LR能促進c-Myc蛋白表達，高濃度MC-LR暴露24h能增強HepG2細胞c-Myc(phosphor S62)磷酸化水平。MC-LR

16、暴露促進HepG2細胞c-fos和c-jun轉錄和蛋白水平提升，說明MC-LR可能引起細胞DNA損傷并誘發(fā)遺傳毒性，而c-myc、c-fos和c-jun可能在MC-LR促進腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　本研究的主要結論:
　　(1)MC-LR的暴露濃度及作用時間影響其對HepG2細胞的毒性，而高濃度MC-LR處理可導致HepG2細胞凋亡，且線粒體和溶酶體與該過程可能密切相關。
　　(2)MC-LR可通過上調HepG

17、2細胞CYP2E1表達或酶活性而誘導細胞產生過量的ROS并對細胞產生毒性。
　　(3)低濃度MC-LR長時間暴露可能會促發(fā)細胞的炎性反應。
　　(4)高濃度MC-LR可通過誘導HepG2細胞產生過量的ROS、激活線粒體細胞凋亡信號途徑而介導細胞凋亡，PUMA和survivin在其中可能發(fā)揮重要作用。
　　(5)高濃度MC-LR暴露也會激活Fas/FasL死亡受體通路，并介導細胞凋亡。
　　(6)MC-LR的肝細胞