納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備及免疫保護(hù)機制初步研究.pdf

1、目的:
　　本課題在綜合分析傳統(tǒng)免疫佐劑的優(yōu)缺點、借鑒現(xiàn)代免疫佐劑的研發(fā)經(jīng)驗和發(fā)展趨勢、在新型納米乳佐劑研究工作的基礎(chǔ)上，有機整合目前人用佐劑中的有效成分、合理優(yōu)化佐劑組分的制劑配比，設(shè)計并制備具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型納米乳佐劑，以金黃色葡萄球菌的全身感染模型為實驗?zāi)Ｐ停谶M(jìn)行其處方優(yōu)化、制劑工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從血清學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平、動物整體水平對其激發(fā)的免疫應(yīng)答譜學(xué)特征及作用機制進(jìn)行系統(tǒng)研究，為新型有效的金黃色葡

2、萄球菌基因工程疫苗的設(shè)計提供一定的實驗基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。
　　方法:
　　第一部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備與表征鑒定
　　(1)通過低能乳化法制備了三種載藥方式的納米乳佐劑疫苗，即包裹載藥疫苗，混合載藥疫苗，聯(lián)合載藥疫苗。
　　(2)通過高速離心法以及粒度分析儀，透射電子顯微鏡，高分辨率電子掃描顯微鏡等充分檢測并評價了納米乳佐劑疫苗的形態(tài)學(xué)特征。
　　第二部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗的免疫學(xué)評

3、價
　　(1)使用制備的三種載藥方式的納米乳佐劑疫苗與MF59佐劑疫苗，經(jīng)6-8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行肌肉注射途徑免疫，分別在第6天，第13天尾靜脈取血，收集血清，無菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｔ谛∈竽┐蚊庖吆蟮?0天，實驗組小鼠均摘眼球收集全血，收集血清，無菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。同時，取血后的小鼠經(jīng)手術(shù)分離脾臟并制備單細(xì)胞懸液，無菌分裝保存于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱備用。
　　(2)ELISA法檢測疫苗免疫后血清的特異性Ig

4、G、IgG1、IgG2a、IgG2b抗體應(yīng)答水平。
　　(3)通過細(xì)胞增殖實驗檢測分離脾細(xì)胞的增殖能力;ELISPOT實驗檢測分離脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ，IL-4的細(xì)胞量;ELISA法檢測分離脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HI抗原刺激后表達(dá)含量變化;流式檢測分離脾淋巴細(xì)胞經(jīng)HI抗原刺激后CD4+T細(xì)胞中記憶性T細(xì)胞含量。
　　(4)疫苗免疫后小鼠感染劑量攻毒后，對主要臟器的細(xì)菌定植量變化檢測;疫苗免疫后小鼠感染劑量攻毒后，對腎臟切片并進(jìn)行

5、HE染色及病理分析;疫苗免疫后小鼠致死劑量攻毒后，對生存率以及疫苗保護(hù)率分析。
　　(5)本論文所有實驗數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0分析，采用非配對T檢驗分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異。所有圖示使用GraphPad Prism6.0軟件制作。P值小于0.05代表有統(tǒng)計學(xué)顯著差異，P值小于0.01代表有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異。
　　第三部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗免疫保護(hù)機制初步研究
　　培養(yǎng)小鼠原代骨髓來源DC細(xì)胞，激光共聚

6、焦技術(shù)檢測納米乳佐劑疫苗被DC細(xì)胞吞噬效率。通過活體成像技術(shù)檢測納米乳佐劑疫苗在皮下注射與肌肉注射兩種給藥方式下的緩釋作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗制備與表征鑒定結(jié)果
　　制備的納米乳佐劑疫苗是穩(wěn)定存在的納米乳球形顆粒，而且分散性良好。通過高分辨率掃描電子顯微鏡分析，更加直觀證明制備的納米乳佐劑疫苗形態(tài)學(xué)特征是粒度均一，分散性良好的球形顆粒。
　　第二部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌

7、疫苗的免疫學(xué)評價結(jié)果
　　(1)疫苗免疫小鼠后的血清學(xué)評價結(jié)果:
　　納米乳佐劑疫苗的包裹載藥方式是一種有高效免疫增強效果的疫苗制備形式。
　　(2)疫苗免疫后小鼠的細(xì)胞學(xué)評價結(jié)果
　　納米乳佐劑疫苗能夠有效的刺激機體產(chǎn)生記憶性細(xì)胞，在抗原二次刺激時，脾淋巴細(xì)胞能夠迅速的增殖分化。
　　包裹載藥疫苗組能夠高效的刺激脾淋巴細(xì)胞分泌與細(xì)胞免疫相關(guān)的IFN-γ以及與體液免疫相關(guān)的IL-4。
　　包裹載藥疫苗

8、組與MF59佐劑疫苗組能夠高效刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，達(dá)到增強疫苗細(xì)胞免疫的效果。
　　納米乳佐劑疫苗能夠有效的提高與IL-4正相關(guān)的體液免疫應(yīng)答水平，其中聯(lián)合載藥方式的疫苗組效果較好，MF59佐劑對增強體液免疫應(yīng)答水平不明顯。
　　MF59佐劑疫苗組能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-10來刺激B細(xì)胞增殖并且抑制Th1細(xì)胞的生成，進(jìn)而促進(jìn)體液免疫應(yīng)答，但是后期促進(jìn)的效果并不明顯。相反包裹載藥疫苗組能夠有效的提高I

9、L-10分泌的含量，并與時間成正相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步證明，包裹載藥方式的疫苗是一種能夠有效刺激產(chǎn)生體液免疫相關(guān)的疫苗形式。
　　包裹載藥疫苗能夠高效誘導(dǎo)細(xì)胞分泌產(chǎn)生IL-12，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，與檢測的IFN-γ水平以及結(jié)論類似，進(jìn)一步說明包裹載藥疫苗能夠誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞免疫相關(guān)免疫應(yīng)答。
　　包裹載藥方式疫苗組與MF59佐劑疫苗組均能夠有效刺激產(chǎn)生IL-17，來促進(jìn)機體中性粒細(xì)胞的生長與分化起到清除細(xì)菌的作用。
　　納

10、米乳佐劑疫苗組的包裹載藥方式更容易高效激發(fā)CD4+中心記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生，而MF59佐劑更易刺激機體產(chǎn)生CD4+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞。
　　(3)疫苗免疫后小鼠的系統(tǒng)性評價結(jié)果
　　1)通過與攻毒1天后的對應(yīng)組別相比較，發(fā)現(xiàn)在全身感染3天后，血液以及脾臟的細(xì)菌定植量明顯減少，細(xì)菌定植主要在腎臟，對比感染后1天與3天的結(jié)果，包裹載藥疫苗組能夠有效的提高機體產(chǎn)生細(xì)菌清除效果，從整體器官的水平驗證了該種載藥方式納米乳佐劑疫苗是一種有開

11、發(fā)潛力的疫苗來抵御金黃色葡萄球菌的感染。
　　2)通過對腎臟切片病理損傷的綜合評價，包裹載藥疫苗組能夠產(chǎn)生最輕的病理損傷效果，且與未免疫后攻毒的對照組小鼠相比，具有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異(P＜0.001)。由此提示:腎臟切片病理評分結(jié)果與細(xì)菌定植量檢測結(jié)果相對應(yīng)，再次驗證包裹載藥疫苗組有望成為金黃色葡萄球菌疫苗的潛在候選疫苗。
　　3)3種不同載藥方式的納米乳佐劑疫苗以及MF59佐劑疫苗均能夠產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用，其中包裹載藥方

12、式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組小鼠生存率為90％，混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組小鼠生存率為80％，MF59佐劑疫苗組小鼠生存率為60％，HI疫苗組小鼠生存率為40％，His對照組小鼠生存率為20％。其中包裹載藥方式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的生存率較His對照組有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異(P＜0.01);包裹載藥方式與聯(lián)合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為87.50％，混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為75.00％，

13、MF59佐劑疫苗組的疫苗保護(hù)率為50.00％，HI疫苗組的疫苗保護(hù)率為25.00％。由此提示，納米乳佐劑尤其是包裹載藥方式更能提高動物生存率與疫苗保護(hù)率。
　　第三部分:納米乳佐劑金黃色葡萄球菌疫苗免疫保護(hù)機制初步研究
　　(1)包裹載藥疫苗組免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MHCⅠ分子的表達(dá)最為顯著，較HI疫苗組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，聯(lián)合載藥方式疫苗組次之;其中包裹載藥疫苗組免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MH

14、CⅡ分子的表達(dá)量與HI疫苗組對比，存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，混合載藥方式疫苗組次之;其中混合載藥方式的納米乳佐劑疫苗免疫后小鼠淋巴節(jié)DC細(xì)胞表面中MHCⅡ分子的表達(dá)量與HI疫苗組對比，存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)，包裹載藥方式疫苗組次之。得到推論，包裹載藥疫苗組能夠起到良好的免疫保護(hù)效果，其一個重要原因為更易被DC細(xì)胞捕獲，呈遞，進(jìn)而引發(fā)一系列的免疫級聯(lián)反應(yīng)。
　　(2)激光共聚焦結(jié)果顯示包裹載藥疫苗組較混

15、合載藥方式的納米乳佐劑疫苗以及HI佐劑疫苗均有更加明顯的被DC細(xì)胞捕獲的效果。從而進(jìn)一步驗證了推論，即包裹載藥疫苗組存在“蛋白貯庫”的作用，從而使更多抗原蛋白更易被DC細(xì)胞捕獲，呈遞，激發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　(3)活體成像結(jié)果結(jié)果表明，包裹載藥方式疫苗組在注射部位緩釋的效果更好，因此能夠不斷的釋放抗原被捕獲，引起高效的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論:
　　1.包裹載藥納米乳佐劑疫苗、混合載藥納米乳佐劑疫苗、聯(lián)