新型鳥嘌呤四鏈體合成方法及其在分析傳感中的研究.pdf

1、DNA是主要遺傳信息的載體和調(diào)控者。隨著多學科的交叉發(fā)展，DNA分子不僅僅是具有信息儲存功能的載體，DNA的其他功能的也被發(fā)現(xiàn)。通過特定的篩選過程，人們可以得到一些具有特殊功能的核酸分子，這類核酸稱為功能核酸。功能核酸主要可以分為兩大類:一類是類似于抗原抗體具有識別功能的核酸分子，能結(jié)合特定的目標物，這類DNA或者RNA稱為核酸適配體(Aptamer);另一類是類似于某些酶，可以催化一些反應(yīng)的發(fā)生，這類DNA或者RNA稱為核酶(DNAz

2、yme/RNAzyme)。功能核酸的發(fā)現(xiàn)擴展了人們對于核酸的認識，也為科研工作者提供了新型的分子工具。功能核酸的本質(zhì)是DNA或者RNA，相比于蛋白質(zhì)本質(zhì)的抗體或者酶，合成方法可控，操作簡單，并且化學性質(zhì)穩(wěn)定，不易失活，沒有不同生產(chǎn)批次活性不同的影響。近年來，多種基于功能核酸的分析方法被開發(fā)應(yīng)用于各種生化分析，因其良好的生物相容性和可以識別并結(jié)合特定分子的性質(zhì)，也被應(yīng)用于生物成像和癌癥的治療。
　　功能核酸在行使其功能時，都會形成特

3、定的二級或者三級結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)某種目標物的結(jié)合或者催化活性區(qū)域的產(chǎn)生。具有過氧化物酶活性的DNAzyme是分析化學中常用的功能核酸分子之一，這種DNAzyme是由鳥嘌呤四鏈體及hemin構(gòu)成，因其可以催化底物產(chǎn)生顏色變化而廣泛應(yīng)用于各種目標物的分析。當前這種DNAzyme的研究多集中于已知固定序列的鳥嘌呤四鏈體，隨機序列研究很少，我們主要研究了隨機排列富含鳥嘌呤序列的合成新方法和相關(guān)應(yīng)用。
　　具體內(nèi)容如下:
　　1.隨機排列

4、鳥嘌呤四鏈體的合成新方法
　　本章利用一種無需模板的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal DeoxynucleotidylTransferase，TdT)，來獲得隨機排列的富含鳥嘌呤的長鏈DNA。對獲取的長鏈DNA的性質(zhì)進行考察，發(fā)現(xiàn)當這種富含鳥嘌呤的隨機排列的DNA與hemin結(jié)合后，與一般固定序列的DNAzyme有類似的催化活性。選取三種比例的底物組成，分別考察TdT延伸的產(chǎn)物DNA長度，結(jié)構(gòu)，和DNAzyme活性。其中當d

5、GTP∶dATP=6∶4時，所獲得的TdT延伸產(chǎn)物與hemin形成復合物具有的DNAzyme活性最高。并且，這種隨機排列富含鳥嘌呤的DNA可以與特異性結(jié)合鳥嘌呤四鏈體的熒光染料硫磺素T(Thioflavine T，ThT)結(jié)合，結(jié)合后大大增強ThT的熒光。我們證明了這種隨機排列的富含鳥嘌呤的DNA可以形成鳥嘌呤四鏈體結(jié)構(gòu)，并且具有高效的DNAzyme活性和特異性結(jié)合熒光染料的性質(zhì)，擴大了對于鳥嘌呤四鏈體的認識，提供了產(chǎn)生鳥嘌呤四鏈體的新

6、方法。
　　2.隨機排列鳥嘌呤四鏈體在生物分析中的應(yīng)用
　　基于上一章對于TdT生成的鳥嘌呤四鏈體的研究，我們開發(fā)了一些基于隨機排列的鳥嘌呤四鏈體在生物分析中的應(yīng)用，主要分析對象有目標DNA，蛋白質(zhì)，和酶。相比于傳統(tǒng)的基于DNAzyme作為信號輸出的方法，基于TdT方法生成的鳥嘌呤四鏈體不需要在體系中引入含有DNAzyme的序列，避免預先存在的DNAzyme帶來的背景信號。首先，我們開發(fā)了一種無標記檢測TdT酶活性的方法，因

7、為背景信號低，TdT聚合產(chǎn)生的DNA形成的DNAzyme具有較高活性，此方法具有很高的信背比，為實現(xiàn)低濃度無標記檢測TdT提供了有效方法，檢測限可以達到0.0394U(S/N=3)。其次，由于TdT產(chǎn)生的隨機排列的鳥嘌呤四鏈體結(jié)合染料ThT的速度非?？?，十秒內(nèi)可以達到平衡，利用這個性質(zhì)可以實現(xiàn)TdT的實時監(jiān)測，這也是對TdT實時檢測的首次報道。該方法也可以應(yīng)用于實際樣品中的TdT檢測，我們在10％的人血清中進行了測試，證明此方法有潛力應(yīng)

8、用于臨床診斷。目標DNA的檢測，是通過內(nèi)切酶輔助的信號放大方法(NESA)與TdT產(chǎn)生的DNAzyme聯(lián)用。先將信號探針3'端用磷酸基團封閉，當有目標DNA存在時，內(nèi)切酶識別信號探針與目標DNA形成的雙鏈結(jié)構(gòu)對信號探針進行切割，釋放出含有3'-OH的小片段作為TdT延伸引物，目標DNA從雙鏈結(jié)構(gòu)上脫落進入下一輪循環(huán)。目標蛋白質(zhì)（凝血酶）的檢測，是通過構(gòu)建含有識別凝血酶核酸適配體序列和限制性內(nèi)切酶識別序列形成的封閉發(fā)夾結(jié)構(gòu)，當有凝血酶存在

9、時，由于核酸適配體的識別作用打開發(fā)夾，釋放出與信號探針互補的區(qū)域，引起NESA過程，從而實現(xiàn)目標蛋白的檢測。生化分析中的常見目標DNA，蛋白質(zhì)和酶的成功檢測，表明TdT產(chǎn)生的隨機排列富含鳥嘌呤四鏈體在生物分析中有普遍的適用性。
　　3.隨機排列鳥嘌呤四鏈體用于凋亡細胞的檢測
　　基于前面章節(jié)TdT可以在最優(yōu)比例dNTP條件下聚合產(chǎn)生可以形成鳥嘌呤四鏈體DNA的方法，我們開發(fā)了一種基于隨機排列鳥嘌呤四鏈體用于凋亡細胞檢測的方法

10、。凋亡過程中細胞的基因組DNA會斷裂成180-200 bp的小片段，通過對這些含有缺口的小片段DNA檢測可以反映細胞的凋亡情況。基于隨機排列鳥嘌呤四鏈體的方法可以實現(xiàn)原位免標記檢測凋亡細胞。首先，我們基于隨機排列鳥嘌呤四鏈體實現(xiàn)低濃度單鏈DNA的檢測。然后對質(zhì)粒DNA和Hela細胞的基因組DNA，利用DNaseⅠ酶切處理，再用TdT延伸的方法實現(xiàn)了大分子DNA的檢測?；谝陨蠈嶒灮A(chǔ)，我們開發(fā)了一種基于TdT產(chǎn)生鳥嘌呤四鏈體原位檢測凋亡

11、細胞的方法。并且，此方法與傳統(tǒng)的流式細胞儀定量法和凝膠電泳法取得了一致的結(jié)果。
　　4.超電荷綠色熒光蛋白與G4/hemin復合物的相互作用的研究與應(yīng)用
　　我們首次發(fā)現(xiàn)G4/hemin復合物可以淬滅超電荷綠色熒光蛋白的熒光，而單獨的hemin或者hemin與非G4結(jié)構(gòu)的DNA不能淬滅超電荷綠色蛋白的熒光。為了進一步理解淬滅過程，我們開展了一系列的實驗來探討其淬滅機理。通過對熒光蛋白的發(fā)射光譜與G4/hemin復合物吸收光譜