高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌代謝工程研究.pdf

1、本課題首先利用DNA雙鏈斷裂誘導重組的原理開發(fā)了一套高效無痕遺傳修飾系統(tǒng)，并利用該技術通過逆向代謝工程策略，將鑒定的核黃素高產(chǎn)有利突變通過等位基因置換至枯草芽孢桿菌野生菌，重構了一株核黃素生產(chǎn)菌。進一步利用理性代謝工程策略，代謝工程修飾核黃素合成途徑和嘌呤合成途徑，獲得高產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌工程菌株。
　　建立枯草芽孢桿菌高效無痕遺傳修飾系統(tǒng)。通過過表達枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞形成的關鍵基因 comK，實現(xiàn)底物誘導快速形成超級感受態(tài)

2、細胞；構建 upp為負篩選標記宿主菌，融合PCR獲得修飾片段，I-SceI誘導DNA雙鏈斷裂的重組修復，可實現(xiàn)連續(xù)/迭代地等位基因置換、基因插入、敲除及基因組大片段刪除。外源dsDNA片段的重組效率高達3000~5000 cfu/μg dsDNA，是傳統(tǒng)Spizizen轉化效率100倍以上。DNA雙鏈斷裂誘導的修復，使短同源區(qū)（30bp）重組效率提升10-100倍。
　　通過無痕遺傳修飾系統(tǒng)，以敲除upp基因的B.subtilis

3、 BSW4作為基礎菌株，將鑒定的核黃素高產(chǎn)有利突變（ribC，ribG+，purA，ccpN，yhcF，ywaA，yvrH）迭代引入，重構一株核黃素生產(chǎn)菌BSW54。搖瓶發(fā)酵驗證工程菌BSW54產(chǎn)量達到298.90 mg/L，與僅含ribC突變點BSW5菌株相比，核黃素產(chǎn)量提升496.01％。
　　在重構菌BS77基礎上過表達核黃素操縱子基因。過表達ribA基因構建工程菌BS89，核黃素產(chǎn)量為506.45 mg/L，較宿主菌BS7

4、7提高1.4倍，同時核黃素比生成速率從32.85±2.66μmolg-1CDWh-1提高至41.65±1.51μmolg-1CDWh-1。RT-PCR結果顯示工程菌BS89的核黃素操縱子基因轉錄水平顯著提升2倍，說明ribA基因過表達能夠顯著提高核黃素合成途徑代謝通量。然而，利用P43置換一級啟動子ribP1與ribO區(qū)域以及ribO區(qū)域敲除的兩種組成型過表達核黃素操縱子實驗策略，均未取得理想效果。
　　通過解調(diào)嘌呤合成途徑轉錄水