枯草芽孢桿菌利用甘油生產(chǎn)核黃素的初步研究.pdf

1、本文初步探討了利用進化工程和代謝工程相結合的手段改進枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）代謝甘油合成核黃素的能力。首先經(jīng)過適應性實驗室進化優(yōu)化了出發(fā)菌株（B. subtilis BSU45）在甘油培養(yǎng)基上的生長性能，并在此基礎上考察了其呼吸鏈、嘌呤途徑、戊糖磷酸途徑和核黃素操縱子的相關基因修飾對菌株利用甘油合成核黃素能力的影響。
　　通過78次的連續(xù)傳代培養(yǎng)對出發(fā)菌株進行了適應性進化，得到的進化菌株（BSU3-78-

2、2）在甘油基本鹽培養(yǎng)基上的比生長速率由0.34 h-1提高到0.43 h-1，生長性能明顯改善。
　　為了提高菌體的產(chǎn)能效率，通過對編碼呼吸鏈分支氧化酶細胞色素bd的cyd基因的無痕敲除，得到了菌株BSUL2，通過搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，菌株BSUL2的核黃素產(chǎn)量達到43.8 mg/L，相比于出發(fā)菌株BSUL1，核黃素的產(chǎn)量提高了10％，并且工程菌對甘油的利用速率并沒有受到影響。
　　用P43啟動子過表達了嘌呤途徑的purFMNHD，

3、但是核黃素產(chǎn)量并沒有顯著提升，推測在宿主菌BSUL1中，嘌呤途徑的通量還不是限制菌株合成核黃素的主要因素。
　　過表達非氧化戊糖磷酸途徑的ywjH基因使核黃素的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到58.2 mg/L，提高了32.9%；而過表達谷氨酸棒桿菌氧化戊糖磷酸途徑的zwf243或gnd361不能提高核黃素的產(chǎn)量，表明在枯草芽孢桿菌利用甘油合成核黃素時，前體物5-磷酸核酮糖（Ru5P）主要是通過非氧化戊糖磷酸途徑提供的。
　　通過游離型質(zhì)粒