枯草芽孢桿菌利用甘油生產(chǎn)核黃素的初步研究.pdf

1、本文初步探討了利用進(jìn)化工程和代謝工程相結(jié)合的手段改進(jìn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）代謝甘油合成核黃素的能力。首先經(jīng)過適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化優(yōu)化了出發(fā)菌株（B. subtilis BSU45）在甘油培養(yǎng)基上的生長性能，并在此基礎(chǔ)上考察了其呼吸鏈、嘌呤途徑、戊糖磷酸途徑和核黃素操縱子的相關(guān)基因修飾對菌株利用甘油合成核黃素能力的影響。
　　通過78次的連續(xù)傳代培養(yǎng)對出發(fā)菌株進(jìn)行了適應(yīng)性進(jìn)化，得到的進(jìn)化菌株（BSU3-78-

2、2）在甘油基本鹽培養(yǎng)基上的比生長速率由0.34 h-1提高到0.43 h-1，生長性能明顯改善。
　　為了提高菌體的產(chǎn)能效率，通過對編碼呼吸鏈分支氧化酶細(xì)胞色素bd的cyd基因的無痕敲除，得到了菌株BSUL2，通過搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，菌株BSUL2的核黃素產(chǎn)量達(dá)到43.8 mg/L，相比于出發(fā)菌株BSUL1，核黃素的產(chǎn)量提高了10％，并且工程菌對甘油的利用速率并沒有受到影響。
　　用P43啟動(dòng)子過表達(dá)了嘌呤途徑的purFMNHD，

3、但是核黃素產(chǎn)量并沒有顯著提升，推測在宿主菌BSUL1中，嘌呤途徑的通量還不是限制菌株合成核黃素的主要因素。
　　過表達(dá)非氧化戊糖磷酸途徑的ywjH基因使核黃素的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到58.2 mg/L，提高了32.9%；而過表達(dá)谷氨酸棒桿菌氧化戊糖磷酸途徑的zwf243或gnd361不能提高核黃素的產(chǎn)量，表明在枯草芽孢桿菌利用甘油合成核黃素時(shí)，前體物5-磷酸核酮糖（Ru5P）主要是通過非氧化戊糖磷酸途徑提供的。
　　通過游離型質(zhì)粒