LPS處理對豬背最長肌能量代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在探索LPS模擬的炎癥模型下，豬背最長肌中能量代謝的變化，以期能全面的評價(jià)炎癥對豬骨骼肌的影響，并闡明可能的機(jī)制，為今后找到合適的緩解治療藥物提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)分為兩組:正常對照組和LPS處理組，分析肌肉中ATP、ADP等的濃度，研究LPS處理后肌肉糖酵解水平、線粒體功能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的變化情況，并檢測了胞漿和線粒體中鈣離子濃度的變化;此外還分析了LPS處理對肌肉生長分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)情況的影響。
　　1.LPS處理對

2、豬背最長肌能量代謝的影響
　　選擇12±0.5kg的雄性杜x長x大三元仔豬12頭，按體重相接近隨機(jī)分為2組:對照組和LPS(15μg/kg BW)注射組，對照組注射相同體積的生理鹽水。注射6h后屠宰采樣，用含抗凝素的EP管收集頸部靜脈血液樣品，并制得血清同采集的肌肉組織一并放入-80℃冰箱保存。利用全自動(dòng)生化分析儀，檢測血液中的血糖和乳酸含量;利用高壓液相檢測肌肉組織中ATP、ADP等能量基本物質(zhì)的含量;利用試劑盒檢測了相關(guān)酶活和

3、鈣離子濃度;并利用RT-PCR和WesternBlot技術(shù)檢測了相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS注射6h后血糖并沒有發(fā)生顯著性變化，但是血液中乳酸卻顯著性上升。NADH的含量顯著性上調(diào)（P＜0.05），NADH/NAD+的比值和ATP的含量有上升的趨勢（P=0.064）;ATP、ADP、AMP和NAD+無顯著性變化。糖酵解的大部分關(guān)鍵基因都顯著性上升（P＜0.05）;糖酵解通路的3個(gè)關(guān)鍵酶HK、LDH和PK的酶活都顯著性上調(diào)了

4、(P＜0.05)。線粒體自身編碼的基因并沒有顯著性變化，但是線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的酶活顯著性上升(P＜0.05)，而線粒體中ATP的含量顯著性下降(P＜0.05)。UCP3的基因顯著性上調(diào)(P＜0.05)，蛋白無顯著性變化。由于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能之間相互偶聯(lián)，我們檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的狀態(tài)，結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的大部分基因都顯著性上調(diào)，標(biāo)志性蛋白BIP顯著性下降(P＜0.05)，CHOP蛋白顯著性上調(diào)（P＜0.05）。鈣離子的檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)總

5、體鈣離子的濃度無顯著性變化，但是線粒體內(nèi)的鈣離子濃度顯著升高（P＜0.05）。我們的結(jié)果提示LPS處理顯著增強(qiáng)了肌細(xì)胞的糖酵解途徑，并可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的鈣交流，介導(dǎo)了肌細(xì)胞線粒體的功能紊亂。
　　2.肌肉注射LPS對豬背最長肌生長相關(guān)基因的影響
　　選擇12頭體重約為12±0.5kg的雄性杜x長x大三元仔豬，并隨機(jī)分為2組:對照組和LPS(15μg/kg BW)注射組，對照組注射相同體積的生理鹽水。注射6h后屠宰采

6、樣，樣品保存于-80℃冰箱。RT-PCR的結(jié)果顯示LPS處理組IGF-1的基因顯著性下降(P＜0.05)，但是IGF1R和mTOR的基因表達(dá)無顯著性變化。自噬相關(guān)基因LC3顯著性上升了（P＜0.05），ULK和ATG6有上升的趨勢（P=0.063），ATG7和ATG9無顯著性變化。蛋白檢測的結(jié)果顯示ATG7無顯著性變化。檢測泛素蛋白酶系統(tǒng)的幾個(gè)關(guān)鍵基因的變化，結(jié)果顯示Foxo1、atrogin-1和MuRF-1的基因顯著性上調(diào)(P＜0.

7、05)。蛋白檢測的結(jié)果顯示MuRF-1無顯著性變化。MSTN的基因和蛋白表達(dá)水平均無顯著性變化。檢測MRFs家族的基因和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示MyoD和MyoG都顯著性下降(P＜0.05)，而Myf5和Myf6的基因顯著性上調(diào)(P＜0.05)。MyoG、Myf5和Myf6的蛋白檢測顯示其表達(dá)均無顯著性變化。我們的結(jié)果提示LPS注射后顯著下調(diào)了IGF-1的表達(dá)，同時(shí)也增加肌肉萎縮的自噬和泛素蛋白酶系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，可能對肌肉生長產(chǎn)生不利影響