萊蕪豬和大白豬背最長(zhǎng)肌miRNA與mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及特征分析.pdf

1、豬不但可以作為重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物為人類提供大量的肉類產(chǎn)品，而且還可以作為模式生物用于醫(yī)學(xué)研究。由于遺傳背景及人工選育方式的不同，造成了中外豬種在生產(chǎn)性狀方面存在很大的差異。比如，萊蕪豬作為我國(guó)特有的豬種資源，具有肉質(zhì)優(yōu)良的種質(zhì)特性;而西方豬種雖然在生長(zhǎng)速度方面具有優(yōu)勢(shì)，但是其較差的肉品質(zhì)已不滿足于消費(fèi)者的需求。大量研究證實(shí)中外豬種間種質(zhì)差異的形成與基因的差異表達(dá)有關(guān)，因此，從轉(zhuǎn)錄組水平探索中外豬種骨骼肌差異表達(dá)基因，對(duì)于解析品種間的差異

2、及揭示形成該差異的分子機(jī)理具有重要作用。
　　本研究選用生長(zhǎng)速度慢但肉質(zhì)優(yōu)良的萊蕪豬(Laiwu pig，LW)和生長(zhǎng)速度快但肉質(zhì)較差的大白豬(Yorkshire，YS)作為試驗(yàn)動(dòng)物，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了萊蕪豬與大白豬骨骼肌中的差異表達(dá)miRNA與差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)miRNA與基因進(jìn)行篩選及信號(hào)通路富集，分析差異miRNA與差異基因在中外豬種中的功能。對(duì)于差異表達(dá)miRNA，采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了這些miRNA可能的

3、靶基因，構(gòu)建了差異表達(dá)miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。為了驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的正確性，我們采用qRT-PCR方法對(duì)差異表達(dá)miRNA與差異基因進(jìn)行了定量驗(yàn)證，結(jié)果表明，高通量測(cè)序結(jié)果比較可靠。本研究的主要結(jié)果如下:
　　(1)萊蕪豬與大白豬骨骼肌小RNA測(cè)序分析
　　分別構(gòu)建了3個(gè)萊蕪豬與3個(gè)大白豬的背最長(zhǎng)肌小RNA文庫(kù)，并利用RNA-seq技術(shù)對(duì)6個(gè)小RNA文庫(kù)進(jìn)行了測(cè)序，分析miRNA在萊蕪豬與大白豬中的表達(dá)模式。結(jié)果表明，平均

4、在每個(gè)萊蕪豬的小RNA文庫(kù)中獲得了13，493，607的純凈測(cè)序reads，大白豬約為12，938，257。總共篩選出265個(gè)已知miRNA，其中有229個(gè)在6個(gè)文庫(kù)中都表達(dá);另外，還預(yù)測(cè)到94個(gè)新miRNA。對(duì)篩選出的359個(gè)miRNA進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ssc-miR-1在兩個(gè)品種豬中都是表達(dá)量最高的，而ssc-miR-194b-5p在兩個(gè)品種豬中的差異倍數(shù)最大（6.35倍）;此外，還發(fā)現(xiàn)有25個(gè)miRNA在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中

5、是顯著差異表達(dá)(q＜0.05)。在25個(gè)差異顯著的miRNA中，有10個(gè)miRNA在萊蕪豬中上調(diào)表達(dá)，15個(gè)下調(diào)表達(dá)。為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取了16個(gè)miRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，qRT-PCR結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致。對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果獲得了10，806個(gè)靶基因，而這些靶基因主要被富集到代謝過(guò)程等信號(hào)通路中。
　　(2)萊蕪豬與大白豬骨骼肌mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析
　　為了研究萊蕪豬與大白

6、豬骨骼肌全基因組的轉(zhuǎn)錄譜，利用RNA-seq技術(shù)對(duì)構(gòu)建的兩個(gè)品種豬骨骼肌文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示在萊蕪豬的文庫(kù)中獲得了40，498，476的測(cè)序reads，大白豬為59，072，892;其中，80％以上的測(cè)序reads可以比對(duì)到豬的基因組中。在兩個(gè)文庫(kù)中共檢測(cè)到12種選擇性剪切類型分析，其中以TSS（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）與TTS（轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)）兩種剪切類型所占的比例最大，分別占到43％和40％以上。通過(guò)對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示

7、在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中有10，482個(gè)共表達(dá)基因，另有739個(gè)基因只在萊蕪豬中表達(dá)，712個(gè)基因只在大白豬中表達(dá)。在兩個(gè)品種豬中總共預(yù)測(cè)得到1，678個(gè)新基因，其中對(duì)應(yīng)2，229個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。為了更進(jìn)一步研究這些差異基因的功能，對(duì)這些差異基因進(jìn)行檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中有178個(gè)顯著差異表達(dá)的基因(q＜0.05)，其中，相對(duì)于大白豬，在萊蕪豬中有98個(gè)差異基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá)，80個(gè)下調(diào)表達(dá)。為了驗(yàn)證這些差異基因的正確性，隨

8、機(jī)選取了12個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致，兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.93)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要被富集到代謝通路，尤其是與脂肪代謝相關(guān)的信號(hào)通路，比如脂肪酸合成代謝通路等。
　　(3)骨骼肌差異miRNA與差異基因關(guān)聯(lián)分析
　　為了從整個(gè)轉(zhuǎn)錄水平了解兩個(gè)品種豬差異表達(dá)miRNA及差異基因的功能，對(duì)178個(gè)差異表達(dá)基因與25個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行

9、關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明只有10個(gè)miRNA在關(guān)聯(lián)分析中達(dá)到顯著水平(q＜0.05)，上調(diào)表達(dá)4個(gè)、下調(diào)表達(dá)6個(gè)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，6個(gè)下調(diào)miRNA對(duì)20個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因具有調(diào)控作用;4個(gè)上調(diào)miRNA對(duì)20個(gè)下調(diào)表達(dá)差異基因具有調(diào)控作用。
　　綜上所述，本研究從miRNA和mRNA兩個(gè)水平系統(tǒng)研究了兩個(gè)品種豬骨骼肌差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能注釋、通路分析及互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控分析等;并采用qRT-PCR方法驗(yàn)證了部分差異