萊蕪豬和大白豬背最長肌miRNA與mRNA轉錄組測序及特征分析.pdf

1、豬不但可以作為重要的農業(yè)經濟動物為人類提供大量的肉類產品，而且還可以作為模式生物用于醫(yī)學研究。由于遺傳背景及人工選育方式的不同，造成了中外豬種在生產性狀方面存在很大的差異。比如，萊蕪豬作為我國特有的豬種資源，具有肉質優(yōu)良的種質特性;而西方豬種雖然在生長速度方面具有優(yōu)勢，但是其較差的肉品質已不滿足于消費者的需求。大量研究證實中外豬種間種質差異的形成與基因的差異表達有關，因此，從轉錄組水平探索中外豬種骨骼肌差異表達基因，對于解析品種間的差異

2、及揭示形成該差異的分子機理具有重要作用。
　　本研究選用生長速度慢但肉質優(yōu)良的萊蕪豬(Laiwu pig，LW)和生長速度快但肉質較差的大白豬(Yorkshire，YS)作為試驗動物，利用高通量測序技術分析了萊蕪豬與大白豬骨骼肌中的差異表達miRNA與差異表達基因，并對差異表達miRNA與基因進行篩選及信號通路富集，分析差異miRNA與差異基因在中外豬種中的功能。對于差異表達miRNA，采用生物信息學軟件預測了這些miRNA可能的

3、靶基因，構建了差異表達miRNA的調控網絡圖。為了驗證高通量測序結果的正確性，我們采用qRT-PCR方法對差異表達miRNA與差異基因進行了定量驗證，結果表明，高通量測序結果比較可靠。本研究的主要結果如下:
　　(1)萊蕪豬與大白豬骨骼肌小RNA測序分析
　　分別構建了3個萊蕪豬與3個大白豬的背最長肌小RNA文庫，并利用RNA-seq技術對6個小RNA文庫進行了測序，分析miRNA在萊蕪豬與大白豬中的表達模式。結果表明，平均

4、在每個萊蕪豬的小RNA文庫中獲得了13，493，607的純凈測序reads，大白豬約為12，938，257?？偣埠Y選出265個已知miRNA，其中有229個在6個文庫中都表達;另外，還預測到94個新miRNA。對篩選出的359個miRNA進行表達分析，結果發(fā)現ssc-miR-1在兩個品種豬中都是表達量最高的，而ssc-miR-194b-5p在兩個品種豬中的差異倍數最大（6.35倍）;此外，還發(fā)現有25個miRNA在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中

5、是顯著差異表達(q＜0.05)。在25個差異顯著的miRNA中，有10個miRNA在萊蕪豬中上調表達，15個下調表達。為了驗證測序結果的準確性，隨機選取了16個miRNA進行qRT-PCR驗證，qRT-PCR結果與測序結果基本一致。對差異表達miRNA的靶基因進行預測，結果獲得了10，806個靶基因，而這些靶基因主要被富集到代謝過程等信號通路中。
　　(2)萊蕪豬與大白豬骨骼肌mRNA轉錄組測序分析
　　為了研究萊蕪豬與大白

6、豬骨骼肌全基因組的轉錄譜，利用RNA-seq技術對構建的兩個品種豬骨骼肌文庫進行測序，測序結果顯示在萊蕪豬的文庫中獲得了40，498，476的測序reads，大白豬為59，072，892;其中，80％以上的測序reads可以比對到豬的基因組中。在兩個文庫中共檢測到12種選擇性剪切類型分析，其中以TSS（轉錄起始位點）與TTS（轉錄終止位點）兩種剪切類型所占的比例最大，分別占到43％和40％以上。通過對測序reads進行比對分析，結果顯示

7、在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中有10，482個共表達基因，另有739個基因只在萊蕪豬中表達，712個基因只在大白豬中表達。在兩個品種豬中總共預測得到1，678個新基因，其中對應2，229個新轉錄本。為了更進一步研究這些差異基因的功能，對這些差異基因進行檢驗分析，結果表明在萊蕪豬與大白豬骨骼肌中有178個顯著差異表達的基因(q＜0.05)，其中，相對于大白豬，在萊蕪豬中有98個差異基因為上調表達，80個下調表達。為了驗證這些差異基因的正確性，隨

8、機選取了12個差異表達基因進行qRT-PCR驗證，測序結果與qRT-PCR結果基本一致，兩者具有很強的相關性(R2=0.93)。對差異表達基因進行功能注釋，發(fā)現差異表達基因主要被富集到代謝通路，尤其是與脂肪代謝相關的信號通路，比如脂肪酸合成代謝通路等。
　　(3)骨骼肌差異miRNA與差異基因關聯分析
　　為了從整個轉錄水平了解兩個品種豬差異表達miRNA及差異基因的功能，對178個差異表達基因與25個差異表達miRNA進行

9、關聯分析，結果表明只有10個miRNA在關聯分析中達到顯著水平(q＜0.05)，上調表達4個、下調表達6個。關聯分析結果表明，6個下調miRNA對20個上調差異表達基因具有調控作用;4個上調miRNA對20個下調表達差異基因具有調控作用。
　　綜上所述，本研究從miRNA和mRNA兩個水平系統(tǒng)研究了兩個品種豬骨骼肌差異表達基因，并對這些差異表達基因進行了功能注釋、通路分析及互作網絡調控分析等;并采用qRT-PCR方法驗證了部分差異