豬背最長肌差異表達基因的克隆鑒定及其特征分析.pdf

1、骨骼肌是動物體內(nèi)最豐富的組織，占肉用動物體重的45％～60％，其生長發(fā)育是肉用家畜最重要的性狀之一。不同豬種由于來源、長期所處的地理環(huán)境以及所接受的飼養(yǎng)方式和選育性狀重點的不同，從而形成了各自的種質(zhì)特性，使其在肌肉相關(guān)性狀方面存在較大的差異。兩個具有不同性狀的親本雜交產(chǎn)生的雜種在肌肉生長、肌肉品質(zhì)等方面也往往超過其雙親，產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的現(xiàn)象。隨著人們對基因結(jié)構(gòu)和功能的研究深入，人們已經(jīng)認識到這些差異及雜種優(yōu)勢現(xiàn)象應(yīng)是基因差異表達的結(jié)果。所

2、以本研究以豬背最長肌為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了不同豬種(長白與梅山)以及豬雜交親代與子代(大白與長大)背最長肌間的正反向消減cDNA文庫，進行了差異表達基因的篩選、克隆和鑒定，取得了如下結(jié)果： 1.以管家基因G3PDH作為消減指標，對每個消減文庫的消減效率進行了檢測，結(jié)果表明4個消減文庫的消減效率都達25倍以上，有的甚至高達210倍，這同時也表明了某些特異于兩種肌肉組織的差異表達基因的富集效率也達25倍以上，說明所構(gòu)建的

3、消減cDNA文庫質(zhì)量很好。 2.從以梅山豬為Tester、長白豬為Driver和以雜交母本大白豬為Tester、雜種F1長大豬為Driver的消減cDNA文庫中我們分別隨機挑取了800多個克隆。利用PCR技術(shù)進行鑒定，分別獲得了759和773個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于150～750bp之間。 3.利用正向消減cDNA、反向未消減cDNA、反向消減cDNA作探針對兩消減cDNA文庫中的陽性克隆進行了高通量篩選。

4、在以梅山豬為Tester、長白豬為Driver的消減cDNA文庫中，我們選取了27個差異表達克隆進行分析，發(fā)現(xiàn)共代表14個ESTs,4個在豬中為已知基因，10個在豬中為未知基因，其中7個與人等其他物種的基因有高同源性，3個未找到明顯的同源性。在以雜交母本大白豬為Tester、雜種F1長大豬為Driver的消減cDNA文庫中，我們選取了24個差異克隆進行分析，發(fā)現(xiàn)共代表12個ESTs，5個在豬中為已知基因，7個在豬中為未知基因，但分別與人

5、等其他物種的基因有高的同源性。并利用含內(nèi)標化的半定量RT-PCR技術(shù)進行了驗證，結(jié)果表明大部分為差異表達。 4.將電腦克隆和SMART技術(shù)相結(jié)合，成功克隆了7個差異表達全長基因：(1)CCNG1，GenBank登錄號為AY974246，cDNA全長2359bp，ORF為888bp；(2)EEF1A，cDNA全長1777bp，ORF為1389bp；(3)ETFB-like，cDNA全長898bp，ORF為765bp；(4)HUMM

6、LC2B，GenBank登錄號為AY754870，cDNA全長681bp，ORF為510bp；(5)PGK1，GenBank登錄號為AY677198，cDNA全長1789bp，ORF為1254bp；(6)TXNIP，cDNA全長1880bp，ORF為1176bp；(7)CKM，GenBank登錄號為AY754869，cDNA全長1572bp，ORF為1146bp。其中，CCNG1、EEF1A、ETFB-like在梅山豬中高表達，HUMM

7、LC2B、PGK1、TXNIP、CKM在雜交母本大白豬中高表達，在雜種F1長大豬中低表達或不表達。 5.利用CLUSTALw等軟件對豬CCNG1、EEF1A、ETFB-like、HUMMLC2B、PGK1、TXNIP、CKM基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進化等特征進行了預測和分析，并進行了分子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。 6.利用含內(nèi)標化的半定量RT-PCR技術(shù)對所獲得的差異基因進行了不同品種間(大白、長白、梅山、杜洛克

8、、通城、長大、大梅、梅大)、不同發(fā)育階段間(胚胎、初生、二月齡、四月齡、六月齡)、不同組織類型間(心、肝、脾、肺、腎、胰、小腸、卵巢、睪丸、胃、子宮、脂肪、股二頭肌、半棘肌、背最長肌)的時空特異性表達分析，這些基因的表達特異性可能與其功能密切相關(guān)。 7.利用PCR-Walking技術(shù)，擴增了其中3個基因的全部內(nèi)含子序列和其他基因的部分基因組序列，并分析了其在不同豬種中的多態(tài)性：(1)CCNG1，7491bp，包含6個內(nèi)含子和7個

9、外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了23個SNP位點，顛換突變4個，轉(zhuǎn)換突變17個，插入突變1個，缺失突變1個。另外，在陽新豬CCNG1的第二內(nèi)含子上還存在一個21bp的“AATGAATCTGTGTACTGAATC”插入。(2)HUMMLC2B，2936bp，GenBank登錄號為AY870651，包含6個內(nèi)含子和7個外顯子。在外顯子4到外顯子7(包括部分第4、7外顯子)的序列上，發(fā)現(xiàn)了13個SNP位點，顛換突變4個，轉(zhuǎn)換突變9個。另外，在第4內(nèi)

10、含子上還存在一個GA→TC的雙突變。(3)TXNIP，3331bp，包含7個內(nèi)含子和8個外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了11個SNP位點，顛換突變3個，轉(zhuǎn)換突變8個。(4)PGK1，1105bp，包含部分第9、11外顯子以及完整的第9、10內(nèi)含子和第10外顯子序列，在其上發(fā)現(xiàn)了8個SNP位點，顛換突變1個，轉(zhuǎn)換突變7個。(5)KIAA1717，2032bp，3’UTR，GenBank登錄號為AY900164，在其上發(fā)現(xiàn)了3個SNP位點，全為轉(zhuǎn)

11、換突變。所有內(nèi)含子5’端都為GT，3’端都為AG，符合“GT-AG”法則。 8.利用PCR-RFLP技術(shù)，對其中4個SNP位點在不同豬群中進行了基因分型。并在大白×梅山F2中與性狀進行了相關(guān)分析，結(jié)果表明：MS60-2-NcoⅠ-RFLP的不同基因型主要與肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分極顯著相關(guān)；MS60-345-1-TspEⅠ-RFLP的不同基因型主要與背膘厚、肌內(nèi)水分顯著相關(guān)；DB245-2-MspⅠ-RFLP的不同基因型主要與眼肌寬、