豬背最長肌差異表達(dá)基因的克隆鑒定及其特征分析.pdf

1、骨骼肌是動物體內(nèi)最豐富的組織，占肉用動物體重的45％～60％，其生長發(fā)育是肉用家畜最重要的性狀之一。不同豬種由于來源、長期所處的地理環(huán)境以及所接受的飼養(yǎng)方式和選育性狀重點(diǎn)的不同，從而形成了各自的種質(zhì)特性，使其在肌肉相關(guān)性狀方面存在較大的差異。兩個具有不同性狀的親本雜交產(chǎn)生的雜種在肌肉生長、肌肉品質(zhì)等方面也往往超過其雙親，產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的現(xiàn)象。隨著人們對基因結(jié)構(gòu)和功能的研究深入，人們已經(jīng)認(rèn)識到這些差異及雜種優(yōu)勢現(xiàn)象應(yīng)是基因差異表達(dá)的結(jié)果。所

2、以本研究以豬背最長肌為材料，利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了不同豬種(長白與梅山)以及豬雜交親代與子代(大白與長大)背最長肌間的正反向消減cDNA文庫，進(jìn)行了差異表達(dá)基因的篩選、克隆和鑒定，取得了如下結(jié)果： 1.以管家基因G3PDH作為消減指標(biāo)，對每個消減文庫的消減效率進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明4個消減文庫的消減效率都達(dá)25倍以上，有的甚至高達(dá)210倍，這同時(shí)也表明了某些特異于兩種肌肉組織的差異表達(dá)基因的富集效率也達(dá)25倍以上，說明所構(gòu)建的

3、消減cDNA文庫質(zhì)量很好。 2.從以梅山豬為Tester、長白豬為Driver和以雜交母本大白豬為Tester、雜種F1長大豬為Driver的消減cDNA文庫中我們分別隨機(jī)挑取了800多個克隆。利用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，分別獲得了759和773個有效陽性克隆，插入片段長度主要分布于150～750bp之間。 3.利用正向消減cDNA、反向未消減cDNA、反向消減cDNA作探針對兩消減cDNA文庫中的陽性克隆進(jìn)行了高通量篩選。

4、在以梅山豬為Tester、長白豬為Driver的消減cDNA文庫中，我們選取了27個差異表達(dá)克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共代表14個ESTs,4個在豬中為已知基因，10個在豬中為未知基因，其中7個與人等其他物種的基因有高同源性，3個未找到明顯的同源性。在以雜交母本大白豬為Tester、雜種F1長大豬為Driver的消減cDNA文庫中，我們選取了24個差異克隆進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共代表12個ESTs，5個在豬中為已知基因，7個在豬中為未知基因，但分別與人

5、等其他物種的基因有高的同源性。并利用含內(nèi)標(biāo)化的半定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明大部分為差異表達(dá)。 4.將電腦克隆和SMART技術(shù)相結(jié)合，成功克隆了7個差異表達(dá)全長基因：(1)CCNG1，GenBank登錄號為AY974246，cDNA全長2359bp，ORF為888bp；(2)EEF1A，cDNA全長1777bp，ORF為1389bp；(3)ETFB-like，cDNA全長898bp，ORF為765bp；(4)HUMM

6、LC2B，GenBank登錄號為AY754870，cDNA全長681bp，ORF為510bp；(5)PGK1，GenBank登錄號為AY677198，cDNA全長1789bp，ORF為1254bp；(6)TXNIP，cDNA全長1880bp，ORF為1176bp；(7)CKM，GenBank登錄號為AY754869，cDNA全長1572bp，ORF為1146bp。其中，CCNG1、EEF1A、ETFB-like在梅山豬中高表達(dá)，HUMM

7、LC2B、PGK1、TXNIP、CKM在雜交母本大白豬中高表達(dá)，在雜種F1長大豬中低表達(dá)或不表達(dá)。 5.利用CLUSTALw等軟件對豬CCNG1、EEF1A、ETFB-like、HUMMLC2B、PGK1、TXNIP、CKM基因結(jié)構(gòu)、所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、系統(tǒng)進(jìn)化等特征進(jìn)行了預(yù)測和分析，并進(jìn)行了分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。 6.利用含內(nèi)標(biāo)化的半定量RT-PCR技術(shù)對所獲得的差異基因進(jìn)行了不同品種間(大白、長白、梅山、杜洛克

8、、通城、長大、大梅、梅大)、不同發(fā)育階段間(胚胎、初生、二月齡、四月齡、六月齡)、不同組織類型間(心、肝、脾、肺、腎、胰、小腸、卵巢、睪丸、胃、子宮、脂肪、股二頭肌、半棘肌、背最長肌)的時(shí)空特異性表達(dá)分析，這些基因的表達(dá)特異性可能與其功能密切相關(guān)。 7.利用PCR-Walking技術(shù)，擴(kuò)增了其中3個基因的全部內(nèi)含子序列和其他基因的部分基因組序列，并分析了其在不同豬種中的多態(tài)性：(1)CCNG1，7491bp，包含6個內(nèi)含子和7個

9、外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了23個SNP位點(diǎn)，顛換突變4個，轉(zhuǎn)換突變17個，插入突變1個，缺失突變1個。另外，在陽新豬CCNG1的第二內(nèi)含子上還存在一個21bp的“AATGAATCTGTGTACTGAATC”插入。(2)HUMMLC2B，2936bp，GenBank登錄號為AY870651，包含6個內(nèi)含子和7個外顯子。在外顯子4到外顯子7(包括部分第4、7外顯子)的序列上，發(fā)現(xiàn)了13個SNP位點(diǎn)，顛換突變4個，轉(zhuǎn)換突變9個。另外，在第4內(nèi)

10、含子上還存在一個GA→TC的雙突變。(3)TXNIP，3331bp，包含7個內(nèi)含子和8個外顯子。在全序列中，發(fā)現(xiàn)了11個SNP位點(diǎn)，顛換突變3個，轉(zhuǎn)換突變8個。(4)PGK1，1105bp，包含部分第9、11外顯子以及完整的第9、10內(nèi)含子和第10外顯子序列，在其上發(fā)現(xiàn)了8個SNP位點(diǎn)，顛換突變1個，轉(zhuǎn)換突變7個。(5)KIAA1717，2032bp，3’UTR，GenBank登錄號為AY900164，在其上發(fā)現(xiàn)了3個SNP位點(diǎn)，全為轉(zhuǎn)

11、換突變。所有內(nèi)含子5’端都為GT，3’端都為AG，符合“GT-AG”法則。 8.利用PCR-RFLP技術(shù)，對其中4個SNP位點(diǎn)在不同豬群中進(jìn)行了基因分型。并在大白×梅山F2中與性狀進(jìn)行了相關(guān)分析，結(jié)果表明：MS60-2-NcoⅠ-RFLP的不同基因型主要與肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分極顯著相關(guān)；MS60-345-1-TspEⅠ-RFLP的不同基因型主要與背膘厚、肌內(nèi)水分顯著相關(guān)；DB245-2-MspⅠ-RFLP的不同基因型主要與眼肌寬、