嵌段共聚物膠束基因載體在促進內(nèi)皮細胞增殖方面的研究.pdf

1、本文致力于設(shè)計和制備基于聚乙烯亞胺(PEI)的低毒性，高轉(zhuǎn)染效率的新型基因載體，以期將促進內(nèi)皮細胞增殖的ZNF580基因質(zhì)粒遞送到EA. hy926內(nèi)皮細胞內(nèi)，通過基因轉(zhuǎn)染和表達，實現(xiàn)促進血管內(nèi)皮細胞(ECs)的增殖和遷移的目的。
　　1.將低分子量聚乙烯亞胺(PEI, Mw=1800)和聚乙二醇單甲醚(mPEG)分別接枝到可生物降解的聚乳酸-co-羥基乙酸(PLGA)上，得到嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-(聚乳酸-co-羥基乙酸

2、)(mPEG-b-PLGA)和PEI-b-PLGA-b-PEI。經(jīng)過上述兩種嵌段共聚物的自組裝，制備出以PLGA為疏水核，以mPEG和PEI為混合殼層的復合膠束，并負載了能促ECs增殖的DNA質(zhì)粒pEGFP-ZNF580(綠色熒光蛋白融合質(zhì)粒pEGFP-ZNF580)。通過改變殼層mPEG和PEI的比例可以較容易的降低膠束的細胞毒性或提高膠束/質(zhì)粒 DNA(pDNA)復合物的轉(zhuǎn)染效率。利用動態(tài)光散射(DLS)研究了復合膠束體外的降解過程

3、；DLS結(jié)果表明復合膠束和膠束/pDNA復合物的粒徑和zeta電位均適合于細胞內(nèi)吞；(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)比色法(MTT)細胞毒性實驗表明當復合膠束中mPEG-b-PLGA/PEI-b-PLGA-b-PEI比例為3/1時，復合膠束表現(xiàn)出低的細胞毒性；細胞增殖實驗表明，該復合膠束/pDNA復合物能夠促進內(nèi)皮細胞的增殖。
　　2.為了平衡膠束基因載體的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，以實現(xiàn)基因載體較高的轉(zhuǎn)染效

4、率，同時降低載體的細胞毒性，制備了兩種兩親性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚(乳酸-3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)(mPEG-b-PLMD)和聚乙烯亞胺-b-聚(乳酸-3(S)-甲基-嗎啉-2,5-二酮)-b-聚乙烯亞胺(PEI-b-PLMD-b-PEI)，通過這兩種共聚物在水溶液中的自組裝，制備出一系列以PLMD為內(nèi)核，mPEG和PEI鏈段為殼層的復合膠束。采用這種復合膠束做為基因載體，負載了能促 ECs增殖的DNA質(zhì)粒pEGF

5、P-ZNF580。膠束及膠束/pDNA復合物的流體力學直徑(Dh)和zeta電位的測定結(jié)果表明，該基因載體的粒徑和zeta電位都適合于細胞內(nèi)吞和細胞轉(zhuǎn)染；膠束/pDNA復合物的MTT實驗和轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)復合膠束殼層中mPEG/PEI比例可以方便的調(diào)控基因載體的細胞毒性和細胞的轉(zhuǎn)染效率；Western blot分析結(jié)果表明該基因載體可以促進轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)ZNF580蛋白的表達，而且隨著復合膠束殼層中PEI鏈段比例的增加，轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)

6、ZNF580蛋白的表達水平是逐漸升高的；此外，劃痕實驗證明了經(jīng)由膠束/pDNA復合物轉(zhuǎn)染的EA.hy926細胞的遷移能力也得到了增強。因此，這種復合膠束作為基因載體成功的負載了pEGFP-ZNF580質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染EA.hy926細胞，通過細胞內(nèi)ZNF580基因的成功表達，細胞的增殖和遷移能力明顯增強，這將加速內(nèi)皮化過程。這種基因載體系統(tǒng)制備策略可以通過簡單調(diào)節(jié)復合膠束殼層中 mPEG/PEI的比例，便捷的調(diào)控基因載體的細胞毒性和細胞轉(zhuǎn)染效

7、率。
　　3.為了實現(xiàn)基因載體高效進入ECs，以提高基因載體對ECs的轉(zhuǎn)染效率，將內(nèi)皮細胞選擇性多肽引入嵌段共聚物膠束體系，制備了一種靶向性基因載體。合成了一種兩親性星型嵌段共聚物，(PLMD-b-PEI)6，然后通過馬來酰亞胺-聚乙二醇-N-羥基丁二酰亞胺(MAL-PEG-NHS)將能特異性吸附內(nèi)皮細胞的活性多肽 CREDVW連接到共聚物上，得到(PLMD-b-PEI-b-PEG-CREDVW)6。通過該嵌段共聚物在水溶液中的自

8、組裝得到以疏水的PLMD為核，聚陽離子PEI為殼，高親水性的PEG鏈段為冠的核-殼-冠型膠束，該膠束的最外層連接了能特異性吸附內(nèi)皮細胞的活性多肽 CREDVW。本章用該膠束作為靶向基因載體，負載了能促進 ECs增殖的pEGFP-ZNF580質(zhì)粒。MTT實驗結(jié)果表明，該基因載體具有較低細胞毒性，并且靶向性多肽的引入可以進一步降低基因載體的細胞毒性；體外轉(zhuǎn)染實驗和Western blot分析證明了這種基因載體可以壓縮包裹pEGFP-ZNF5

9、80，并攜帶該基因質(zhì)粒進入內(nèi)皮細胞，使ZNF580基因在細胞內(nèi)成功的轉(zhuǎn)染并表達，細胞內(nèi)ZNF580蛋白水平也隨之提高；劃痕實驗表明，經(jīng)這種靶向性基因載體轉(zhuǎn)染的EA.hy926細胞的遷移能力也同時增強，24 h后，兩種連接靶向多肽的膠束/pDNA復合物轉(zhuǎn)染的細胞的遷移面積分別達到76.2％(PEI/PEG=1/1)和78.5%(PEI/PEG=1/2)。
　　4.制備了兩親性嵌段共聚物 PEI-b-PLMD-b-PEI，通過該嵌段共

10、聚物在水溶液中的自組裝形成了以疏水的PLMD為內(nèi)核，陽離子聚合物PEI為殼的膠束。通過聯(lián)二硫基雙(琥珀酰亞胺丙酸鹽)(DSP)將低分子量PEI(Mw=600)交聯(lián)在膠束的殼層上，連接成較高分子量的PEI殼層，可以促進ECs增殖的質(zhì)粒pEGFP-ZNF580通過和PEI的靜電作用被壓縮包裹到膠束的殼層。這種通過交聯(lián)劑將低分子量PEI連接成較大分子量 PEI可以提高基因載體的轉(zhuǎn)染效率，同時這種載體具有較低的細胞毒性，隨著材料濃度的增加，PE