新型多功能肽類基因載體的設(shè)計(jì)及綜合性能研究.pdf

1、基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療疾病的目的。基因治療已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有前景的研究方向之一。近些年發(fā)展的RNA干擾技術(shù)和基因組靶向編輯技術(shù)，特別是最新的CRISPER/Cas9系統(tǒng)為基因治療提供了革命性技術(shù)手段，但是由于基因治療所要遞送的DNA、RNA或寡核苷酸等分子量過大且?guī)в写罅控?fù)電荷，很難到達(dá)靶組織和細(xì)胞發(fā)揮作用，因此安全、有效的基因遞送載體成為了基因治療的關(guān)鍵

2、。本論文的目的就是設(shè)計(jì)和合成安全、有效的多肽類基因遞送載體。
　　目前臨床應(yīng)用最廣泛、最高效的是病毒類載體，但是因?yàn)槠涠拘?、免疫源性、致癌作用和難以大規(guī)模生產(chǎn)等問題難以克服，科學(xué)家們也一直通過設(shè)計(jì)非病毒載體來解決這些問題。近些年，多肽以其較好的生物相容性、功能多樣性和易于合成和修飾等特點(diǎn)成為一類很有發(fā)展前景的非病毒載體。
　　在本論文中，我們針對(duì)非病毒載體基因遞送過程中面臨的障礙，如細(xì)胞透膜、內(nèi)涵體逃逸、進(jìn)入細(xì)胞核、體內(nèi)抗酶

3、降解和疾病組織靶向等問題，利用多肽功能的多樣性、易于合成和修飾的特點(diǎn)，尋找能夠克服基因遞送障礙的功能多肽分子，并將多肽分子這些特點(diǎn)有機(jī)地組合在一起，協(xié)同發(fā)揮作用，最終得到了一系列轉(zhuǎn)染效率高、生物安全性好的新型多功能片段組裝的多肽類基因載體。本文主體分為三部分:
　　1、針對(duì)非病毒載體所面臨的基因的負(fù)載、細(xì)胞透膜、內(nèi)涵體逃逸、進(jìn)入細(xì)胞核這幾個(gè)主要的細(xì)胞水平基因遞送障礙，進(jìn)行多功能載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
　　多肽載體設(shè)計(jì)包括:透膜肽TAT

4、介導(dǎo)復(fù)合物內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞;α-螺旋抗菌肽(LLKK)3片段破壞內(nèi)涵體將DNA納米復(fù)合物釋放到細(xì)胞質(zhì)最終進(jìn)入細(xì)胞核;硬脂酸基團(tuán)在分子內(nèi)部提供疏水環(huán)境可以提高該類多肽的α-螺旋度，使(LLKK)3片段中亮氨酸和賴氨酸分別分布于α-螺旋的兩側(cè)，一側(cè)親水，有利于賴氨酸和質(zhì)粒DNA結(jié)合形成穩(wěn)定致密的納米復(fù)合物，另一側(cè)疏水，亮氨酸與脂質(zhì)雙層膜融合以提高細(xì)胞內(nèi)吞和內(nèi)涵體逃逸效率;半胱氨酸的巰基可以發(fā)生交聯(lián)，起到穩(wěn)定多肽/DNA復(fù)合物的作用，避免DNA降

5、解。通過系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和功能評(píng)價(jià)，最終得到了兩個(gè)高活性、低毒性的多肽基因載體，轉(zhuǎn)染效率與商用脂質(zhì)體Lipofecatamie2000相當(dāng)。另外為了提高肽序列的透膜和體內(nèi)抗酶解能力，我們還設(shè)計(jì)了由D型氨基酸組成的多肽載體，其細(xì)胞和小動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明:細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率進(jìn)一步提高了數(shù)倍。
　　在實(shí)驗(yàn)中，我們用MALDI-TOF質(zhì)譜對(duì)多肽的分子量進(jìn)行了確認(rèn)，用圓二色譜儀對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析;利用瓊脂糖凝膠電泳、動(dòng)態(tài)光散射、透

6、射電子顯微鏡等方法，對(duì)多肽載體的DNA結(jié)合能力、多肽/DNA復(fù)合物的粒徑、zeta電位和表觀形貌進(jìn)行了分析;用流式細(xì)胞儀、共聚焦顯微鏡等技術(shù)，對(duì)多肽載體的DNA遞送能力、內(nèi)涵體逃逸效率、轉(zhuǎn)染效率和多肽介導(dǎo)DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制等進(jìn)行了研究;并對(duì)多肽以及多肽/DNA復(fù)合物的安全性分別進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們還利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)對(duì)全D型氨基酸組成的C18-c(llkk)3c-tat(D型氨基酸多肽用小寫字母表示)動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，

7、結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率與陽性對(duì)照Lipofecatamie2000相當(dāng)。
　　2、引入組氨酸，進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)涵體逃逸能力的載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
　　內(nèi)涵體吞噬是基因遞送過程的一個(gè)關(guān)鍵障礙，組氨酸能夠在酸性的內(nèi)涵體中不斷吸收質(zhì)子，通過“質(zhì)子海綿”效應(yīng)漲破內(nèi)涵體，基因/載體復(fù)合物得以釋放至細(xì)胞質(zhì)。在上述肽序列的基礎(chǔ)上，我們通過組氨酸替換賴氨酸或加入組氨酸肽片段的方式設(shè)計(jì)了四個(gè)新的多肽載體，通過將組氨酸的質(zhì)子海綿作用與α螺旋抗菌肽的打孔作用結(jié)合

8、，以期達(dá)到更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　在實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了4個(gè)載體的DNA結(jié)合能力，多肽/DNA復(fù)合物的粒徑和在NIH-3T3中的轉(zhuǎn)染活性，結(jié)果顯示:這四個(gè)載體均能很好地結(jié)合DNA，并形成粒徑較小、形狀規(guī)則的納米顆粒，轉(zhuǎn)染效率大大提高。其中最高的C18-C(LLHH)3C-TAT比上一章中活性最高的全D型載體C18-c(llkk)3c-tat提高了7.8倍，比陽性對(duì)照Lipofectamine2000和PEI25kDa分別高出21.9倍

9、和17.2倍。由此可見，將組氨酸序列與α螺旋肽適當(dāng)組合，使前者質(zhì)子海綿作用與后者的細(xì)胞打孔作用疊加，可有效提高DNA轉(zhuǎn)染效率，是一種科學(xué)、可行的基因遞送載體設(shè)計(jì)新策略。
　　3、針對(duì)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，透過血腦屏障的載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
　　以陽離子透膜肽為主的基因遞送載體的問題之一是缺乏細(xì)胞靶向能力，在全身給藥時(shí)很難達(dá)到理想的治療效果，特別是腦內(nèi)疾病。細(xì)胞表面有諸多生物大分子，行使與各自配體特異性相互作用的功能。RVG（YTIWMPE

10、NPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG）是來源于狂犬病毒糖蛋白的一個(gè)29肽，能夠與神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)的乙酰膽堿受體特異性結(jié)合，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有很好的靶向能力。本文中，我們利用自然連接反應(yīng)將RVG29肽與上述設(shè)計(jì)1、2中的基因載體偶聯(lián)，靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，嘗試設(shè)計(jì)一種高效、安全轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞的載體。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們合成的RVG-c(llkk)3-tat和RVG-c(llhh)3-tat兩個(gè)載體仍能很好結(jié)合DNA，形成較小粒徑

11、的納米顆粒，對(duì)大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染效率明顯高于脂質(zhì)體Lipofectamine2000。加入RVG靶向序列與c(llkk)3-tat相比，轉(zhuǎn)染效率大大提高，可見RVG在轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞時(shí)對(duì)提高轉(zhuǎn)染效率發(fā)揮了重要作用。
　　除了本文正文中重點(diǎn)介紹了三類21個(gè)多肽基因載體以外，文中還按照以上的多肽組裝策略還合成了34個(gè)多功能片段組裝的多肽類基因載體，并對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)合DNA的能力、基因遞送

12、和轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，由于篇幅所限未在正文中詳述。具體如下（附錄1、2）:1、天然產(chǎn)物樺木酸(Betulinic acid, BA)和齊墩果酸(Oleanolic acid, OA)作為疏水性基團(tuán)替換硬脂酸得到2個(gè)基因載體，BA-g(llkk)3g-tat和OA-g(llkk)3g-tat，其轉(zhuǎn)染效率與C18-C(LLKK)3C-TAT相當(dāng)。據(jù)報(bào)道樺木酸具有抗腫瘤和抗炎活性，在以后的實(shí)驗(yàn)中將聯(lián)合基因治療對(duì)其抗腫瘤效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。2、在透膜

13、肽N端修飾兩個(gè)棕櫚酸(Palmitic acid，PA)得到PA-K(PA)R9TAT，試圖利用疏水作用提高透膜肽的基因轉(zhuǎn)染效率，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其內(nèi)涵體逃逸能力較弱，未能達(dá)到理想的轉(zhuǎn)染效果。3、利用HIV-1 gp41蛋白中的融合肽(FP23、HGP、sHGP和PVI等)作為內(nèi)涵體逃逸功能片段，合成了FP23KR9K-PVI、 FP23KR9K-CH6、 FP23KR9K-sHGP、 FP23KR9K-SV40、Chol-KR9K-sHG

14、P、Chol-KR9K-PVI等多肽載體，但由于其透膜能力較差，造成轉(zhuǎn)染效率較低。4、利用抗菌肽(LLRR)3和pexiganan(pexi)與透膜肽、硬脂酸等進(jìn)行組合，得到基因載體(LLRR)3和C18-Pex-TAT等，但此類毒性較大，只做了主要指標(biāo)評(píng)價(jià)。
　　本文的創(chuàng)新在于:1、利用多肽化合物的結(jié)構(gòu)、功能多樣性，選取病毒或細(xì)菌的蛋白中對(duì)基因遞送發(fā)揮重要作用的功能多肽，或是根據(jù)這些天然多肽的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)人工設(shè)計(jì)多肽，并通過化