基于香菇多糖結(jié)構(gòu)的pH敏感型多功能基因載體的初步研究.pdf

1、香菇多糖是自然界廣泛存在的一種生物大分子，它的活性成份為β-(1→3)-D-葡聚糖，具有抗腫瘤等生物活性。多糖具有多種物理化學(xué)特性，因此可以作為有效的基因傳遞載體，影響癌癥治療的關(guān)鍵問題之一就是缺乏安全有效的基因傳遞載體。我們通過對(duì)香菇多糖上羥基進(jìn)行化學(xué)修飾，以香菇多糖為骨架材料與低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)通過pH敏感型化學(xué)鍵鍵合，制備出pH敏感型香菇多糖(LNT-PEI)。LNT-PEI可作為藥物或核酸載體，使得藥物或核酸在體內(nèi)發(fā)

2、揮更好的藥效，與此同時(shí)，LNT-PEI中敏感型化學(xué)鍵在體內(nèi)斷裂，釋放香菇多糖，在疾病治療過程中，起到多重治療作用。研究內(nèi)容主要包括：
　　1.基于香菇多糖結(jié)構(gòu)的pH敏感型多功能基因載體的構(gòu)建與表征。利用高碘酸鉀氧化香菇多糖上的羥基；席夫堿反應(yīng)連接乙二胺；將胺基化多糖與 PEI進(jìn)行反應(yīng)，制備出LNT-PEI。用FTIR和1H-NMR表征新載體的結(jié)構(gòu)，再通過納米粒度儀檢測(cè)，檢測(cè)LNT-PEI的電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，香菇多糖成功鍵合上PE

3、I， LNT-PEI的表面電荷為+17.7 mV，由此表明，LNT-PEI成功合成。為了考察LNT-PEI是否具有pH敏感型，在一定條件下是否可以斷裂，釋放香菇多糖，我們將LNT-PEI分別放在pH5.5的弱酸環(huán)境、pH8.0的弱堿環(huán)境以及PBS溶液中，透析48 h，通過凍干獲得產(chǎn)物，用FTIR以及電位來表征產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，F(xiàn)TIR結(jié)果顯示，于弱酸弱堿中透析的產(chǎn)物只有香菇多糖的特征峰，而于 PBS溶液中透析的產(chǎn)物與 LNT-PEI紅外吸收峰基

4、本相同；電位結(jié)果顯示，于弱酸弱堿中透析的產(chǎn)物電位為負(fù)值，與香菇多糖電位相似，經(jīng)PBS溶液透析的產(chǎn)物電位為+16.7mV，與LNT-PEI相似。這表明LNT-PEI通過pH敏感型化學(xué)鍵連接。
　　2. LNT-PEI體外實(shí)驗(yàn)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LNT-PEI體外可以成功負(fù)載核酸，MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明LNT-PEI基本無細(xì)胞毒性。我們用乳腺癌細(xì)胞MCF-7考察載體體外轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，載體與核酸在質(zhì)量比為20:1時(shí)，能夠?qū)?/p>

5、BMI-1-siRNA成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，LNT-PEI/siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為83.5％。為了進(jìn)一步證明載體在pH5.5以及pH8.0條件下可以斷裂，釋放香菇多糖，而在 PBS溶液中可以穩(wěn)定存在，我們通過凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)來表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LNT-PEI在pH5.5以及pH8.0的條件下透析后失去負(fù)載核酸的能力，而在PBS溶液中透析的產(chǎn)物仍能負(fù)載核酸。
　　3. LNT-PEI體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。為了考察LNT-PEI是否具

6、有香菇多糖的生物活性，我們以S180荷瘤小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，尾靜脈注射香菇多糖以及LNT-PEI，比較荷瘤小鼠每天體重以及腫瘤體積的變化，連續(xù)給藥后，取出腫瘤組織、脾臟、肝臟、胸腺，腫瘤組織進(jìn)行HE染色，觀察每個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的差別；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LNT-PEI組腫瘤抑制率為62.60%；提取脾臟組織的RNA，進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LNT-PEI能提高IL-2、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)量，且與香菇多糖組IL-2、IFN-γ、TNF