氧化葡萄糖酸桿菌木糖醇脫氫酶和D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因的克隆與協(xié)同表達(dá).pdf

1、木糖醇因其吸濕性、甜度和外觀都與蔗糖相似，產(chǎn)熱少，對人體無害，有益于齲齒的預(yù)防，并且其代謝不受胰島素影響等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域，在國際上供不應(yīng)求。近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，“綠色”生產(chǎn)觀念的深入，生物法生產(chǎn)木糖醇更符合可持續(xù)發(fā)展的理念，逐漸成為各國學(xué)者開展研究的重點(diǎn)。D-阿拉伯糖醇脫氫酶(D-arabitol dehydrogenase，ArDH)和木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase，XDH

2、)作為木糖醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶，它們的高效表達(dá)對D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇起著至關(guān)重要的作用。因此，構(gòu)建高性能的基因工程菌，對于木糖醇生產(chǎn)效率的提高以及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。
　　本論文利用PCR技術(shù)從氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）中擴(kuò)增出編碼XDH的編碼基因xdh，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE-xdh，并在大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21中得到了高效表達(dá)。 SDS-PAG

3、E分析結(jié)果顯示重組菌BL21-xdh有28 kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過金屬鎳親和層析及Sephacryl S-300凝膠層析純化后，系統(tǒng)地測定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時(shí)，還原反應(yīng)的最適溫度為35℃，最適pH約為5.0，還原反應(yīng)的比活為288.2 U/mg，對D-木酮糖的Km值為66.8 mmol/L，Vmax為140.5μmol/min/mg;當(dāng)以木糖醇為底物時(shí)，氧化反應(yīng)最適溫度為30℃，最適pH約為11.0，氧化反應(yīng)的比活

4、為101.8 U/mg，對木糖醇的Km值為139.4 mmol/L，Vmax為105.3μmol/min/mg。
　　同時(shí)，克隆并表達(dá)了G.oxydans ArDH的編碼基因ardh，構(gòu)建重組菌pSE-ardh，并在大腸桿菌(E.coli) BL21中得到了高效表達(dá);ardh的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示有27 kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)，純化蛋白并測定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時(shí)，還原反應(yīng)的最適溫度為30℃，最適pH約

5、為5.5，還原反應(yīng)的比活為16.2 U/mg，對D-木酮糖的Km值為36.3 mmol/L，Vmax為103.1μmol/min/mg;當(dāng)以D-阿拉伯糖醇為底物時(shí)，氧化反應(yīng)最適溫度為30℃，最適pH約為8.5，氧化反應(yīng)的比活為65.7 U/mg，對D-阿拉伯糖醇的Km值為60.4mmol/L, Vmax為79.8μmol/min/mg。
　　利用重組質(zhì)粒pSE-xdh和pSE-ardh構(gòu)建重組質(zhì)粒pSE-xdh-ardh，并轉(zhuǎn)入E