bacillussp.g3葡萄糖脫氫酶基因的克隆、表達(dá)及其酶性質(zhì)研究

1、浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文Bacillus sp.G3葡萄糖脫氫酶基因的克隆、表達(dá)及其酶性質(zhì)研究姓名：陳雪嬌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：趙宇華20100101浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文A b s t r a c tG l u c o s e d e h y d r o g e n a s e ( G l c D H ，E C 1 ．1 ．1 ．4 7 ) ，am e m b e r o f t h es h o r t —

2、c h a i nf a m i l y o fa l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，c o n s i s t s o f f o u r i d e n t i c a ls u b u n i t s ( 3 0 K D ) ，i tc a t a l y z e s t h e o x i d a t i o no f p - D —g l u c o s e t oD ·g

3、l u c o n o - 6 一l a c t o n e i nt h ep r e s e n c e o f c o f a c t o rN A D + o r N A D P + ．I t h a sb e e n r e p o r t e dt h a t t h eG l c D H p l a y sa n i m p o r t a n t r o l ei ns p o r e g e r m i n a t i

4、 o n , w h i c h i sa m a r k e re n z y m e s y n t h e s i z e da ts t a g e o f s p o r u l a t i o n ．I n r e c e n ty e a r s ，G l c D Hw e r e w i d e l y s t u d i e d a n da p p l i e d i nm a n y f e l d s ，i ．e

5、 ．i n b i o f u e l c e l l s ，c l i n i c a lt e s t s ，a n da sa c a t a l y s tf o r c o e n z y m er e g e n e r a t i o n i nl a r g e - s c a l ec h i r a ls y n t h e s i s ．A tp r e s e n t ，i tW a s e x t r a c

6、t e df r o m t h em a m m a ll i v e r o rt h ef e r m e n t a t i o n p r o d u c t so f B a c i l l u s s p e c i e sp r i m a r i l y , S O t h es o u r c ei sr e s t r i c t e d ．D o m e s t i c G l c D H r e l ym a

7、i n l y o n i m p o r t s ．I nt h i sp a p e r , w e c a r r i e d o u t t h ee x p e r i m e n t t oi s o l a t e t h e G l c D H g e n ef r o m B a c i l l u ss p ．G 3 ，e x p r e s s e d i t i n E ．c o l iB L 2 1 ( D E

8、 3 ) ，a s w e l la st h ep u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i se n z y m e ．T h e r e s u l t s o f t h i sr e s e a r c h w e r e r e p o r t e da sf o l l o w i n g ．( 1 ) T h e g e n

9、e c o d i n gf o rG l c D H w a s i s o l a t e df r o mB a c i l l u ss p ．G 3 ．T h e G l c D H - G 3 g e n e( a c c e s s i o nn o ．G Q 4 0 2 8 3 ) h a s a n o p e n r e a d i n gf r a m eo f 7 8 6 b p a n d c o d e s

10、f o ra p o l y p e p t i d e o f2 6 1 r e s i d u e sw i t h a m o l e c u l a rm a s s o f 2 8k D a p r e d i c t e d b yt h e g e n e s e q u e n c e ．( 2 ) T h e O R F o f G l c D H - G 3 W a S s u c c e s s f u l l y

11、c l o n e da n d l i g a t e d w i t ht h e p E T - 2 8 a ( + ) ．T h e r e c o m b i n e dp l a s m i d s p E T - 2 8 a - g d h w a s t r a n s f o r m e di n t oB L 2 1 ( D E 3 ) c o m p e t e n t c e l l s ，a f t e rI

12、P T G i n d u c t i o n ，t h eG l c D H - G 3 s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i nh e t e r o l o g o u s h o s ts t r a i n E ．c o BB L 2 1 ( D E 3 ) ．( 3 ) T h e G l c D H —G 3 w a s p u r i f i e dt oh o m o

13、g e n e i t y b y N i —N T A —r e s i na n d a c l e a rs i n g l eb a n d W a so b s e r v e d o n S D S —P A G E ．A f t e r b e i n g p u r i f i e d2 0 一f o l d ，t h es p e c i f i ca c t i v i t yo f t h ee r l z y m

14、 e w a s 3 7 1 ．9U ／m g ．( 4 ) T h e p r o p e r t i e so f t h e G l c D H —G 3w e r e s t u d i e d ．T h ee n z y m eW a so p t i m a l l y a c t i v ea t4 0 ℃a n d a p H 9 ．0 ，a n dd i s p l a y e d b r o a d s u b s

15、t r a t es p e c i f i c i t y ．T h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yo f t h er G l c D H - G 3w o u l d b ei m p r o v e d 4 t i m e sw h e nN A D P + W a s u s e d a sc o f a c t o r i n s t e a do f N A D + ．G l c