2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)生菌膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶的分離純化及性質(zhì).pdf

1、2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是食品添加劑D-異抗壞血酸（鈉）的合成前體。膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶(membrane bound glucosedehydrogenase，mGDH，EC1.1.5.2)是2KGA生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可催化氧化D-葡萄糖為D-葡萄糖酸。
　　本論文對(duì)國(guó)內(nèi)2KGA工業(yè)生產(chǎn)用菌球形節(jié)桿菌C224的mGDH進(jìn)行了分離純化和鑒定，系統(tǒng)研究了其酶學(xué)性質(zhì)，初步開(kāi)展

2、了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究，為后續(xù)的mGDH過(guò)量表達(dá)研究及2KGA高效生產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了一定的理論依據(jù)。
　　主要結(jié)論如下:
　　(1)經(jīng)過(guò)超聲波破碎細(xì)胞、Triton X-114兩相分離、丙酮沉淀、聚乙二醇6000(PEG6000)沉淀、乙醇沉淀以及Hydroxyapatite Fast Flow吸附層析等步驟，從球形節(jié)桿菌C224中獲得了比活為88.08 U/mg、純化倍數(shù)達(dá)183.50倍的mGDH。
　　(2)十二

3、烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacryamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析結(jié)果表明，球形節(jié)桿菌C224的mGDH是單體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量大約為90000。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry, MALD

4、I-TOF-MS)分析結(jié)果證實(shí)，從球形節(jié)桿菌C224分離純化的蛋白質(zhì)確實(shí)為吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依賴的mGDH，相對(duì)分子質(zhì)量大約為87000。
　　(3)酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，用2，6-二氯靛酚鈉—吩嗪硫酸甲酯（2，6-dichlorophenolindophenol-phenazine methosulfate，DCIP-PMS）作為電子受體時(shí)，球形節(jié)桿菌C224 mGDH的最適反

5、應(yīng)pH值為6.0;用鐵氰化鉀作為電子受體時(shí)，其最適反應(yīng)pH值為5.0。該酶的最適反應(yīng)溫度為45℃;在pH6.0～7.0和20～40℃條件下，mGDH具有較好的穩(wěn)定性;mGDH具有廣泛的底物譜，D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖或D-木糖均可作為其反應(yīng)底物;Mg2+對(duì)mGDH具有明顯的促進(jìn)作用，而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+及一些常用的有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮和正己烷）對(duì)該酶具有不同程度的抑制作用;低濃度的乙二胺四乙

6、酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)即可完全抑制mGDH的活性，說(shuō)明該酶是金屬離子依賴性酶。
　　(4)在pH5.0、25℃條件下，以D-葡萄糖為底物，mGDH酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax為192.31μmol/mg·min，Km為0.21 mmol/L;當(dāng)?shù)孜餅镈-木糖時(shí)，mGDH酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax為44.05μmol/mg· min，Km為0.34mmol/L;D-半

7、乳糖作為底物時(shí)，mGDH的最大反應(yīng)速率Vmax為18.32μmol/mg· min，Km為0.46 mmol/L;麥芽糖作為底物時(shí)，mGDH的最大反應(yīng)速率Vmax為19.05μmol/mg· min，Km為0.59 mmol/L。雙底物酶促反應(yīng)和產(chǎn)物抑制動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明:球形節(jié)桿菌C224 mGDH的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制為乒乓機(jī)制，即在酶催化反應(yīng)過(guò)程中，首先與mGDH結(jié)合的底物是PMS，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)產(chǎn)物PMSH釋放后D-葡萄糖再與酶結(jié)合，釋