產(chǎn)葡萄糖脫氫酶工程菌發(fā)酵及重組葡萄糖脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase，EC1.1.1.47）是一種NAD(P)+依賴型的氧化還原酶，可以催化NAD(P)+與β-D-葡萄糖反應(yīng)得到NAD(P)H和D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯。GDH在生物催化和燃料電池方面得到越來越廣泛的應(yīng)用。但是GDH來源較少，主要來源于動物肝臟和芽孢桿菌發(fā)酵。本文對重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET11 a(+)-GDH進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)

2、的研究。本論文的主要研究成果如下:
　　(1)對重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET11 a(+)-GDH的搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行了研究，得到了優(yōu)化的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件。優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為:葡萄糖1％，蛋白胨2％，酵母粉0.5％，pH7.5，微量元素加入量2 mL/L;培養(yǎng)條件為:搖瓶裝液量50/250 mL，接種量6％。誘導(dǎo)條件為:誘導(dǎo)時間4h，誘導(dǎo)溫度32℃，誘導(dǎo)后發(fā)酵時間6h，誘導(dǎo)劑濃度1 mM。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下

3、培養(yǎng)該重組菌，得到比酶活為17.44 U/mg。
　　(2)在15L發(fā)酵罐上對重組菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立了分批發(fā)酵的動力學(xué)模型。在分批發(fā)酵基礎(chǔ)上再采用pH-stat補(bǔ)料分批發(fā)酵，得到最大菌體密度為18g/L(DCW)，是分批發(fā)酵的2.25倍，酶活達(dá)到130U/mL，是分批發(fā)酵的3.8倍。
　　(3)優(yōu)化和比較了高壓破胞和超聲破胞兩種破胞工藝。高壓破胞的優(yōu)化工藝條件是破碎時間7 min，菌體濃度0.083g/mL，在此條件下破胞

4、得到的酶活為141.8U/mL，破胞率為98％。超聲破胞的優(yōu)化工藝條件是功率900W，破碎時間9min，菌體濃度0.083 g/mL，但得到的酶活只有99.6 U/mL，破胞率為87％，分別是高壓破胞的70％和88％。
　　(4)研究了鹽析純化后GDH的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明:該GDH的亞基分子量為32kDa。最適反應(yīng)溫度為40℃，穩(wěn)定性對溫度敏感，失活活化能為98.137KJ· moL-1。最適反應(yīng)pH為8，pH穩(wěn)定范圍較寬，為6～