新型酯酶EstZF172的克隆表達(dá)及其在制備普瑞巴林手性中間體中的應(yīng)用.pdf

1、普瑞巴林(Pregabalin)是神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，其作為第二代抗癲癇藥物，已被用于治療多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病，國內(nèi)外市場(chǎng)需求和銷量增勢(shì)顯著。(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯((S)-CNDE)是制備普瑞巴林的重要手性中間體。利用生物拆分法制備光學(xué)純手性中間體(S)-CNDE是一條綠色、高效的路徑，具有良好的的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。
　　本文從實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的具備較高選擇性水解(R)-C

2、NDE能力的菌株P(guān)seudomonas CGMCC No.4184出發(fā)，通過構(gòu)建基因文庫，以CNDE作為底物，用平板水解圈法進(jìn)行初篩并通過手性拆分反應(yīng)進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證，成功獲取了含有目的基因的DNA片段。經(jīng)開放閱讀框分析及亞克隆構(gòu)建重組菌驗(yàn)證，確定了目的基因estZF172，并在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)蛋白EstZF172的可溶性表達(dá)，其酶活為3，948.5 U g-1，較野生菌提高了425倍，拆分rac-CNDE的E值為95。
　　

3、氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，序列中含四個(gè)保守區(qū)域，同時(shí)利用分子模擬分析其三維結(jié)構(gòu)及數(shù)個(gè)重要氨基酸殘基，并采取定點(diǎn)突變策略加以驗(yàn)證;再結(jié)合進(jìn)化樹分析和底物特異性測(cè)試等手段，確定EstZF172為酯酶，隸屬酯酶/脂肪酶家族中的FamilyⅧ，該家族成員與β-內(nèi)酰胺酶和DD-肽酶的相似度極高，活性絲氨酸殘基位于保守區(qū)域S-X-X-K中。以對(duì)硝基苯酚己酸酯為底物，對(duì)純化后的酯酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，確定了該酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃、pH9.0(T

4、ris-HCl緩沖液)，而金屬離子Co2+、 Ni2+、Mn2+和Zn2+，巰基試劑AgNO3和CuSO4，以及表面活性劑SDS和TritonⅩ-100等添加劑則對(duì)該酶有明顯的抑制作用。
　　在LB培養(yǎng)基中對(duì)該重組菌進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，使酶活較優(yōu)化前提高了21％。將重組全細(xì)胞應(yīng)用于拆分外消旋的CNDE制備(S)-CNDE，確定了其過程轉(zhuǎn)化溫度為35℃，pH為8.5。隨后考察了反應(yīng)中的底物、產(chǎn)物抑制情況，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化的全細(xì)胞載量、底物