疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶Lip分子改造及催化合成普瑞巴林手性中間體.pdf

1、普瑞巴林（S-3-氨甲基-5-甲基己酸）是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的結(jié)構(gòu)類似物。由于良好的神經(jīng)病理性疼痛和癲癇治療效果，普瑞巴林已成為“重磅炸彈藥物”。由于S-型普瑞巴林具有更強(qiáng)的藥理活性，不對(duì)稱合成普瑞巴林成為近年來的研究熱點(diǎn)。Pfizer公司開發(fā)的第二代普瑞巴林合成工藝引入商品化脂肪酶Lipolase，選擇性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)，生成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。

2、該手性中間體經(jīng)脫羧、堿性水解、氫化制得普瑞巴林。但該工藝中最關(guān)鍵的生物催化劑，目前只有Novozymes公司的Lipolase(來源于Thermomyces lanuginosus的商品化脂肪酶，TLL)能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，獲得能夠高效拆分CNDE的新催化劑，成為普瑞巴林化學(xué)酶法合成工藝的關(guān)鍵。本論文針對(duì)高效拆分CNDE制備普瑞巴林手性中間體新生物催化劑開發(fā)，從基因挖掘與克隆、異源表達(dá)、分子改造、催化工藝及應(yīng)用等方面開展研究。

3、
　　以立體選擇性拆分CNDE為目標(biāo)反應(yīng)，以高效催化CNDE水解的TLL的氨基酸序列為查詢序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源序列比對(duì)，篩選出與TLL同源性為78％的脂肪酶LN，然后根據(jù)ln基因序列設(shè)計(jì)引物，從T. lanuginosus DSM10635中克隆獲得與ln高度同源的脂肪酶基因lip(GenBank no. KC479729)，并在Escherichia coli中活性表達(dá)。重組大腸桿菌全細(xì)胞催化CNDE水解，產(chǎn)物e

4、e值達(dá)98%，E>200，但活力偏低。此外，以真菌酯酶的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后利用5′-RACE PCR獲得了 T. lanuginosus DSM10635酯酶TLE的全長(zhǎng)序列(945 bp，GenBank no. KF305767)。分別在大腸桿菌和畢赤酵母系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)該酯酶的活性表達(dá)，并利用 Ni-NTA柱純化TLE，研究TLE的基本酶學(xué)性質(zhì)。TLE對(duì)CNDE表現(xiàn)出良好的選擇性(E=95)，與目前報(bào)道的用于CNDE

5、拆分的其它酯酶相比，其選擇性最高，說明該酶有一定的應(yīng)用潛力。
　　為了提高Lip對(duì)CNDE的水解活力，開展了基于定點(diǎn)飽和突變策略的分子改造研究。利用同源建模和分子對(duì)接等技術(shù)，構(gòu)建了脂肪酶Lip的3D結(jié)構(gòu)，分析了可能影響其活力的氨基酸殘基，選擇脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)附近及氧負(fù)離子洞組成氨基酸為突變位點(diǎn)。通過多輪點(diǎn)飽和突變，從突變庫(kù)中篩選到活力明顯提高的突變體S88T/A99N/V116D，其活力(2.35 U/mg)是野生型Lip的60.3

6、倍，與TLL(2.40 U/mg，從Lipolase中純化)相當(dāng)。通過同源建模、分子對(duì)接研究，揭示了酶的結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系，分析了突變體活力提高的機(jī)理：S88T突變能更有效的穩(wěn)定CNDE水解反應(yīng)過程中的酶-底物過渡態(tài)；A99N和V116D突變新形成三對(duì)氫鍵，有利于穩(wěn)定酶蛋白處于蓋子打開狀態(tài)，從而使酶活力提高。
　　為了進(jìn)一步提高Lip對(duì)CNDE的水解活力，以定點(diǎn)飽和突變獲得的突變體Lip-T(S88T/A99N/V116D)為親本，

7、利用易錯(cuò)PCR構(gòu)建隨機(jī)突變庫(kù)，篩選到突變體S63L/D232A，其活力是親本Lip-T的2.0倍。為了驗(yàn)證這兩個(gè)點(diǎn)突變?cè)诨盍μ岣咧械淖饔茫枚c(diǎn)突變技術(shù)分別構(gòu)建單點(diǎn)突變體S63L和D232A，發(fā)現(xiàn)S63L和D232A突變對(duì)酶活的影響截然相反：S63L能有效提高酶活，單突變體S63L的活力是雙突變體S63L/D232A的1.5倍；而D232A突變引起活力的降低，其活力僅為親本的68%。為了考察其它18種氨基酸替換對(duì)活力的影響，分別構(gòu)建了

8、位點(diǎn)63和232的飽和突變文庫(kù)，并篩選到活力更高的突變體S63M/S88T/A99N/V116D，其活力達(dá)到8.68 U/mg，為S88T/A99N/V116D的3.7倍，TLL的3.6倍，野生型Lip的222.6倍。通過同源建模發(fā)現(xiàn)，S63M突變引入疏水性殘基，導(dǎo)致蓋子打開程度更大，有利于底物、產(chǎn)物的出入，從而提高酶活。表達(dá)突變體S63M/S88T/A99N/V116D的大腸桿菌細(xì)胞(5%, w/v)能高效催化3 M(765 g/L)

9、 CNDE選擇性水解，反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率45.2%，ee值98%，在催化劑使用量更少的情況下，已達(dá)到Lipolase(8%, w/v)拆分CNDE的水平。
　　脂肪酶催化CNDE水解過程中，產(chǎn)物抑制作用是影響脂肪酶催化效率的關(guān)鍵因素。論文進(jìn)行了基于離子交換的原位吸附消除產(chǎn)物抑制、提高催化效率的研究，從7種代表性陰離子交換樹脂中篩選出201×7，并考察了其用量對(duì)轉(zhuǎn)化過程的影響。研究了加入陰離子交換樹脂201×7進(jìn)行原位吸附的分批轉(zhuǎn)

10、化過程，向轉(zhuǎn)化體系中加入20%的樹脂后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到45%所需的時(shí)間減半，催化效率加倍(3 M CNDE，反應(yīng)12 h，轉(zhuǎn)化率>45%)，時(shí)空產(chǎn)率從56.25 mmol/L/h提高到112.50 mmol/L/h，催化劑產(chǎn)率從1.125 mmol/h/g提高到2.250 mmol/h/g，分別是Pfizer工藝的2.0倍和3.2倍。分離轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸鈉，在105℃加熱脫羧40 min，