立體選擇性羰基還原酶的篩選及其在手性藥物中間體合成中的應(yīng)用.pdf

1、手性醇含有一個(gè)活潑的羥基官能團(tuán)，是大量重要手性藥物的手性合成砌塊。手性醇合成技術(shù)的改良對(duì)手性藥物的發(fā)展起到了推動(dòng)作用。因此，催化潛手性羰基化合物不對(duì)稱還原生成手性醇的研究具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本論文從立體選擇性羰基還原酶的篩選入手，通過(guò)基因挖掘手段獲取目標(biāo)羰基還原酶，并對(duì)其進(jìn)行底物特異性和催化性能研究，進(jìn)一步應(yīng)用于手性藥物中間體的合成中，實(shí)現(xiàn)高活性高選擇性催化潛手性羰基化合物不對(duì)稱還原合成手性醇。主要內(nèi)容如下：
　　第

2、一部分，立體選擇性羰基還原酶的篩選。通過(guò)羰基還原酶產(chǎn)生菌的篩選，從土壤和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選到兩株具有高羰基還原酶活性的新菌株：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌Burkholderia gladioli ZJB12126和圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides ZJB2014212。利用基因組狩獵以及數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘技術(shù)，獲得48個(gè)目標(biāo)羰基還原酶，構(gòu)成羰基還原酶工具盒。對(duì)工具盒中的重組羰基還原酶進(jìn)行底物特異性研究，最終獲得3個(gè)具有

3、較高催化活性和立體選擇性以及較廣底物譜的羰基還原酶新酶源：BgADH2、BgADH3和RtSCR9。
　　第二部分，重組羰基還原酶的催化性能研究。對(duì)以上3個(gè)羰基還原酶進(jìn)行了分離純化和表征，BgADH2、BgADH3和RtSCR9分子量分別為114.2kDa（四聚體）、63.4kDa（二聚體）和123.7kDa（四聚體）；優(yōu)化后的pH分別為6.5、6.5和7.0；優(yōu)化后的溫度分別為35℃、40℃和35℃；35℃下半衰期分別為17h、

4、85h和113h；對(duì)應(yīng)的失活活化能分別為1.27kJ/mol、10.6kJ/mol和14.6kJ/mol；少數(shù)金屬離子對(duì)酶活有促進(jìn)作用，但EDTA對(duì)酶活影響不大，表明三種酶均屬于金屬非依賴型羰基還原酶。BgADH2和RtSCR9對(duì)輔酶NADPH的Km比輔酶NADH低20-200倍，屬于輔酶NADPH依賴型；而B(niǎo)gADH3對(duì)輔酶NADPH的Km略低于NADH，為NADPH偏好型。
　　第三部分，BgADH2催化合成(2S,3R)-2

5、-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯（MBHB）。建立底物2-苯甲酰氨甲基-3-酮-丁酸甲酯（BMOB）和產(chǎn)物高效液相色譜分析方法，利用手性柱Chiralpak AY-H成功將底物產(chǎn)物6種異構(gòu)體分離，確定其出峰順序和保留時(shí)間。結(jié)合葡萄糖脫氫酶/葡萄糖偶聯(lián)的輔酶再生體系，選擇水-甲苯兩相體系，pH6.5，35℃下催化60mM底物BMOB，8h后產(chǎn)物濃度為55.1mM，產(chǎn)率91.1％，ee達(dá)99.0%，de達(dá)98.5%，高于文獻(xiàn)報(bào)道。進(jìn)一步對(duì)其

6、反應(yīng)機(jī)理和催化機(jī)制進(jìn)行探討，該反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（DYKAT）過(guò)程。酶的催化過(guò)程通過(guò)H的傳遞實(shí)現(xiàn)，底物C=O氧與Try151和Ser138形成氫鍵，從Try151-OH中奪得一個(gè)H，輔酶煙酰胺環(huán)C4上的H傳遞給底物C=O碳。
　　第四部分，BgADH3催化合成(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。構(gòu)建羰基還原酶/葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)體系E.coli/BgADH3-GDH，優(yōu)化后表達(dá)條件：IPTG0.5mM、誘導(dǎo)溫度28 oC和

7、誘導(dǎo)時(shí)間12h。BgADH3酶產(chǎn)量達(dá)55.8U/g濕菌體，GDH酶產(chǎn)量66.5U/g濕菌體。發(fā)酵培養(yǎng)后OD600最高達(dá)36.6，BgADH3體積酶活達(dá)2347.1U/L，GDH體積酶活達(dá)2874.2U/L?？疾炝擞袡C(jī)溶劑對(duì)共表達(dá)菌催化反應(yīng)的影響，選擇水-正辛醇兩相體系，優(yōu)化后底物濃度1200mM，反應(yīng)6h，底物完全轉(zhuǎn)化，ee達(dá)99.9%。進(jìn)一步將反應(yīng)放大至1L反應(yīng)體系，采取底物分批補(bǔ)料的策略，20h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化2400mM底物，產(chǎn)率91.

8、8%，ee達(dá)99.9%。
　　第五部分，重組羰基還原酶RtSCR9介入的化學(xué)-酶法制備(S)-度洛西汀。合成5種度洛西汀中間體噻吩環(huán)酮類底物N,N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺鹽酸鹽2a、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺鹽酸鹽2b、3-氯-1-(2-噻吩基)-丙酮2c、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯2d、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈2e以及相應(yīng)的外消旋醇3a-3e。經(jīng)過(guò)篩選，RtSCR9對(duì)這些化合物均具

9、有較高的催化活力和選擇性（>99%）。構(gòu)建羰基還原酶/葡萄糖脫氫酶共表達(dá)體系E.coli/RtSCR9-GDH，并應(yīng)用于催化不對(duì)稱還原底物2a生成產(chǎn)物(S)-3a。優(yōu)化后葡萄糖添加量6mmol/(mmol2a)、輔酶添加量0.75μmol/(mmol2a)、溫度30 oC、pH6.5、菌體量10g DCW/L和底物濃度1000mM。將反應(yīng)放大至百克級(jí)規(guī)模制備(S)-3a，產(chǎn)率92%，ee達(dá)99.9%，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)22.9mmol/(L·h