親和雙水相膠團(tuán)萃取與荷電磁性粒子輔助蛋白質(zhì)復(fù)性研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的分離純化與體外復(fù)性是基因重組蛋白生產(chǎn)過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。隨著基因工程和發(fā)酵技術(shù)的快速發(fā)展，重組蛋白質(zhì)的種類(lèi)和表達(dá)量不斷提高，急需研發(fā)高效的分離純化和復(fù)性技術(shù)。本文研發(fā)了一種新型親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)分離，以及兩種荷電磁性納米粒子用于輔助同電荷蛋白質(zhì)復(fù)性。
　　雙水相膠團(tuán)萃取是一種簡(jiǎn)單、快速的生物分離技術(shù)，但是選擇性較低。本文開(kāi)發(fā)了一種新型親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)，以提高其分離選擇性，系統(tǒng)研究了該系統(tǒng)的性質(zhì)及其蛋白質(zhì)分離純

2、化性能。首先，通過(guò)在非離子表面活性劑Triton X-114(TX-114)上偶聯(lián)亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid, IDA）基團(tuán)合成了可螯合鎳離子的表面活性劑TX-Ni，研究了TX-Ni與TX-114混合溶液的性質(zhì)。結(jié)果表明，二者在溶液中形成了混合膠束，但是由于空間位阻較大和靜電排斥作用，TX-Ni的加入不利于膠團(tuán)的形成，并且抑制了膠團(tuán)間的聚集。加之IDA基團(tuán)極性大、水化能力強(qiáng)，使系統(tǒng)的濁點(diǎn)溫度隨TX-Ni含量的增大

3、而升高；無(wú)機(jī)鹽對(duì)濁點(diǎn)的影響則符合Hofmeister離子序列，可以通過(guò)加入親液離子降低濁點(diǎn)，使萃取在較低的溫度下進(jìn)行。將親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離純化，研究了帶有六組氨酸標(biāo)簽的重組綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）和溶菌酶在親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)中的分配行為。研究發(fā)現(xiàn)，親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)對(duì)富含組氨酸的蛋白質(zhì)具有高選擇性，在TX-Ni的摩爾分率由0增大至0.1時(shí)EGFP的

4、分配系數(shù)從0.6增大到12.4，提高了20倍。pH和鹽濃度對(duì)分配系數(shù)的影響顯著，說(shuō)明親和作用在萃取過(guò)程中占主導(dǎo)地位。最后，將該親和雙水相膠團(tuán)系統(tǒng)用于細(xì)菌裂解液中萃取EGFP，終產(chǎn)物純度可達(dá)70％，收率大于80%。
　　近年的研究表明，表面修飾有聚電解質(zhì)的聚合物微球能夠有效抑制同電荷蛋白質(zhì)的聚集，從而輔助蛋白質(zhì)復(fù)性。由于微球粒徑越小、電荷密度越高，輔助復(fù)性的效果越好，本文致力于研發(fā)高電荷修飾密度的磁性納米粒子。以N,N,N-三甲基-

5、3-(2-甲基烯丙酰氨基)-1-氯化丙銨（[3-(methacryloylamino)propyl]-trimethylammonium chloride, MAPTAC）和甲基丙烯酸（methacrylic acid, MAA）為單體，通過(guò)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，在Fe3O4納米顆粒表面修飾聚電解質(zhì)。研究表明，制備的陽(yáng)離子磁性納米粒子Fe3O4@PMAPTAC和陰離子磁性納米粒子Fe3O4@PMAA可以具有較高的電荷密度，對(duì)蛋白質(zhì)的靜