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文檔簡介
1、在基因工程表達中,為了表達后純化的需要,常常將融合標簽(6×his)與目標蛋白質(zhì)進行共表達,以利于金屬螯合色譜(IMAC)對其進行分離復性。然而,在純化和復性中,常會因樣品局部濃度過高引起蛋白質(zhì)聚集沉淀,而阻塞色譜柱及影響蛋白質(zhì)的純化和復性。為了減輕這些不利因素,開發(fā)有效和實用的包含體蛋白質(zhì)的復性技術(shù),本文將金屬螯合色譜和人工伴侶系統(tǒng)相耦合,利用基因工程表達產(chǎn)物6×his標記的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)包含體,系統(tǒng)研究了耦合輔助復性
2、作用,并與傳統(tǒng)復性法進行了比較討論。 研究結(jié)果表明,稀釋復性僅能使較低濃度(0.05 mg·mL-1~0.2 mg·mL-1)的包含體蛋白達到較好的復性效果(30%~40%),但當?shù)鞍捉K濃度為0.6 mg·mL-1時,熒光復性收率僅為14%;人工伴侶輔助復性雖然可使復性收率有所提高,但蛋白終濃度為0.6 mg·mL-1~0.8 mg·mL-1時,也只能達到25%左右的熒光復性收率;IMAC可以使高濃度包含體蛋白復性收率明顯提高,
3、在復性蛋白終濃度為0.6mg·mL-1時,熒光復性收率可達60%,質(zhì)量收率達80%;若將IMAC與人工伴侶耦合,相同條件蛋白質(zhì)的復性結(jié)果可進一步提高為熒光復性收率80%,質(zhì)量收率82%。 進一步對耦合輔助復性中關(guān)鍵操作參數(shù)進行優(yōu)化后,即變性蛋白與CTAB的摩爾濃度比為1:5,結(jié)合時間為20min,復性緩沖液的流速為0.4 mL·min-1,復性緩沖液中脲濃度為1.5 mol·L-1,洗脫液中脲濃度為2.5 mol·L-1時,可使
4、終濃度為0.8 mg·mL-1~~1.0 mg·mL-1的目標蛋白質(zhì)達到87%的熒光復性收率和91%的質(zhì)量收率,并且即使在更高的進樣蛋白濃度(5 mg·mL-1)下,仍可獲得69%的熒光復性收率和66%的質(zhì)量收率,充分顯示了耦合輔助復性的優(yōu)勢和在實際應用中的潛力。 此外,本文還通過體積排阻色譜和圓二色光譜對耦合輔助復性的產(chǎn)物進行了分析。結(jié)果表明,復性產(chǎn)物大多為單體EGFP,且產(chǎn)品的二級結(jié)構(gòu)和天然態(tài)綠色熒光蛋白相近。而其它復性方法
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