玉米類胡蘿卜素異構(gòu)酶和番茄紅素ε-環(huán)化酶基因的克隆與鑒定.pdf

1、類胡蘿卜素對(duì)人類營(yíng)養(yǎng)和健康具有重要價(jià)值。類胡蘿卜素主要作為人體的抗氧化劑和維生素A的前體。較高的類胡蘿卜素飲食攝入量與各種類胡蘿卜素缺乏相關(guān)疾病的降低密切相關(guān)[1]。動(dòng)物和人體無(wú)法直接合成類胡蘿卜素，必須從其食物中獲得類胡蘿卜素。谷物里一般缺乏這些化合物，導(dǎo)致一些以谷物為主食國(guó)家的人們患有與類胡蘿卜素缺乏相關(guān)的許多疾病。由于這些原因人們對(duì)植物類胡蘿卜素合成途徑和應(yīng)用遺傳工程技術(shù)改良禾谷類作物以及提高類胡蘿卜素含量的研究產(chǎn)生了極大的興趣。

2、近年來(lái)通過(guò)對(duì)類胡蘿卜素生物合成途徑的遺傳操作在提高主要農(nóng)作物可食用器官的類胡蘿卜素含量方面已取得了可喜的進(jìn)展[2-4]。但在應(yīng)用遺傳工程技術(shù)提高植物靶器官中某一特定類胡蘿卜素含量時(shí)，存在很大的盲目性，這主要是由于目前人們對(duì)植物體內(nèi)類胡蘿卜素合成和積累的調(diào)控機(jī)制等還不甚清楚。為了深入了解玉米(Zea mays L.)種子胚乳中類胡蘿卜素生物合成和積累分子調(diào)節(jié)機(jī)制，我們從玉米自交系B73種子胚乳中克隆了編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶(CRTISO)和

3、番茄紅素ε-環(huán)化酶(LYCE)的基因(cDNAs)。我們克隆到兩個(gè)截然不同的玉米(Zea mays L.)crtiso cDNAs(Zmcrtiso1和Zmcrtiso2)。這兩個(gè)crtiso基因分別位于玉米基因組的不同染色體上。與擬南芥和番茄crtiso基因相似，Zmcrtiso1和Zmcrtiso2基因在玉米基因組中也都具有12個(gè)內(nèi)含子。Zmcrtiso1 cDNA核苷酸序列編碼一個(gè)含587個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量為63.7 k

4、Da，等電點(diǎn)為8.24。用ChloroP1.1信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)ZmCRTISO1蛋白存在一個(gè)含有43個(gè)氨基酸殘基的質(zhì)體信號(hào)肽。在玉米自交系B73中，Zmcrtiso2 cDNA在第143個(gè)核苷酸序列(與Zmcrtiso1 cDNA對(duì)比，Zmcrtiso2 cDNA推測(cè)的翻譯起始密碼子第一個(gè)核苷酸序列為1)位置的堿基從胞嘧啶(C)顛換(transversion)為腺嘌呤(A)。但重要的是，這種堿基顛換(transversion)并不發(fā)生

5、在白玉米M37W，黃玉米EP42和A632以及登錄在國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中的其他玉米品系中(登錄號(hào)：FL133727和EU957482)。玉米自交系B73Zmcrtiso2 cDNA中的這種C到A的單堿基顛換，導(dǎo)致翻譯提前終止而產(chǎn)生無(wú)義突變。因此，預(yù)測(cè)玉米自交系B73Zmcrtiso2 cDNA翻譯成一個(gè)縮短(truncated，或截短)了127個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。研究表明，ZmCRTISO1能將7，9，7’，9’-四順式

6、-番茄紅素(前番茄紅素)轉(zhuǎn)換為全反式番茄紅素，但不能異構(gòu)化含有15-順式雙鍵的9，15，9’-三順式-ζ-胡蘿卜素。在玉米自交系B73，Zmcrtiso2 cDNA由于含有提前終止密碼子，編碼的縮短了的ZmCRTISO2沒(méi)有類胡蘿卜素異構(gòu)酶活性，但在其它的玉米品種中由于缺乏這種DNA單堿基顛換，他們的Zmcrtiso2基因編碼的蛋白質(zhì)(酶)具有與ZmCRTISO1相同的類胡蘿卜素異構(gòu)酶活性的功能。
　　 玉米自交系B73Zmly

7、ce的最長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(ORF，open reading frame)預(yù)測(cè)可編碼537個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；對(duì)其編碼蛋白的預(yù)測(cè)，分子量為59.7 kDa，等電點(diǎn)為6.33。Zmlyce cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列與擬南芥、番茄和黃花龍膽lyce cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列有72.1％到73.8％的相似性(similarity)以及63.2％到63.9％的同一性(identity)。通過(guò)在大腸桿菌中的異源互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(complementation

8、 experiment)證實(shí)，Zmlyce cDNA編碼的LYCE能經(jīng)過(guò)含有一個(gè)ε-紫羅蘭酮(ionone)環(huán)的δ-胡蘿卜素，在δ-胡蘿卜素的另一個(gè)末端添加第二個(gè)ε-紫羅蘭酮環(huán)而生成含有兩個(gè)ε-紫羅蘭酮環(huán)的ε-胡蘿卜素。這與擬南芥，番茄和黃花龍膽LYCE只能催化全反式番茄紅素生成含有一個(gè)ε紫羅蘭酮環(huán)的δ-胡蘿卜素的酶活性明顯不同。
　　 為了探討在玉米種子胚乳中類胡蘿卜素生物合成和積累的分子調(diào)控機(jī)制，我們研究了Zmcrtiso1

9、和Zmcrtiso2 mRNA表達(dá)與玉米種子胚乳中類胡蘿卜素的積累之間的關(guān)系。隨玉米種子胚乳發(fā)育，直到授粉后第25天，Zmcrtiso1和Zmcrtiso2 mRNA在胚乳中的積累量逐漸增加，這與玉米種子胚乳類胡蘿卜素的積累(尤其是β-胡蘿卜素，玉米黃質(zhì)和葉黃體素組分的積累)相一致。Zmcrtiso1 mRNA積累量隨后逐漸降低，而Zmcrtiso2mRNA積累量一直保持到授粉后第30天。我們深入討論了這兩個(gè)Zmcrtiso平行同源基因