番茄紅素-β-環(huán)化酶反義基因?qū)Ψ训倪z傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、番茄紅素不僅影響番茄果實(shí)的顏色，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗氧化和防癌抗癌等作用。番茄是人們獲得番茄紅素的主要來(lái)源之一。目前的普通番茄品種番茄紅素含量普遍不高，因此提高番茄果實(shí)中的番茄紅素含量，對(duì)改善番茄品質(zhì)，為農(nóng)民增收和番茄加工企業(yè)提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要價(jià)值。番茄紅素的合成和降解及其相關(guān)酶和基因的深入研究使得對(duì)番茄中的番茄紅素調(diào)控成為可能。本研究以普通番茄品種TT11117A和靈光3號(hào)為材料，在優(yōu)化番茄再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)

2、法將反義LYC-b基因?qū)敕阎校砸种品鸭t素降解、達(dá)到提高番茄中番茄紅素含量的目的。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了番茄TT11117A和靈光3號(hào)的高頻再生體系 探討了18個(gè)6.BA與IAA不同濃度組合對(duì)番茄再生的影響，結(jié)果表明：2個(gè)番茄品種子葉和下胚軸誘導(dǎo)芽分化的最佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L，誘導(dǎo)不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為：MS+IAA 0.2mg/L。 在芽分化最佳培養(yǎng)

3、基上研究了基因型、外植體類型對(duì)番茄再生的影響，結(jié)果表明：不同基因型的同一種外植體分化率存在極顯著差異，TT11117A同一種外植體的分化率極限著高于靈光3號(hào)；同一基因型不同外植體的分化率存在極顯著差異，子葉的分化率最高，下胚軸次之，子葉節(jié)最低。 2.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系 在篩選出的誘導(dǎo)芽分化和誘導(dǎo)不定芽生根的最佳培養(yǎng)基上，分別研究了番茄子葉外植體和不定芽對(duì)卡那霉素的敏感性，結(jié)果表明：芽分化階段Kan的篩選壓

4、力以60mg/L，不定芽生根階段Kan的篩選壓力以30mg/L為宜。抗性植株篩選方法：芽誘導(dǎo)階段和不定芽生根階段進(jìn)行兩次篩選。 探討了預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、抑菌素濃度對(duì)番茄轉(zhuǎn)化效率的影響，建立了番茄高效遺傳轉(zhuǎn)化體系：子葉外植體黑暗預(yù)培養(yǎng)48h，以MS液體培養(yǎng)基稀釋的新鮮農(nóng)桿菌(含Anti-LYC-b 5'+GUS/pBINPLtJS植物表達(dá)載體)侵染外植體，侵染菌液濃度OD600=0.5，侵染時(shí)間10

5、min，共培養(yǎng)時(shí)間為36h，濃度為500 mg/L的頭孢霉素能很好的抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，又能減少對(duì)外植體的傷害。 3.獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株以子葉為轉(zhuǎn)化受體，使用高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系 將反義LYC-b基因?qū)敕?，獲得了9株TT11117A抗性植株，26株靈光3號(hào)抗性植株，其中1株TT11117A和4株靈光3號(hào)抗性株GUS檢測(cè)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性株率分別為11.1％，15.3％，PCR檢測(cè)結(jié)果表明GUS檢測(cè)陽(yáng)性株均能擴(kuò)增出39

6、7bp的目的條帶，Nos．Ter引物對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄的PCR檢測(cè)表明GUS檢測(cè)陽(yáng)性株均能擴(kuò)增出192bp的條帶，進(jìn)一步證明反義Lyc-b5，基因已經(jīng)整合到番茄基因組中，RT-PCR結(jié)果顯示目的基因已經(jīng)在RNA水平表達(dá)。 4.對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄植株番茄紅素含量進(jìn)行了初步檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因植株葉片中的番茄紅素和胡蘿卜素含量測(cè)定表明，2個(gè)品種轉(zhuǎn)基因植株葉片中的茄紅素含量高于陰性對(duì)照，并達(dá)到顯著水平，而且轉(zhuǎn)基因植株葉片中的茄紅素含量均高于胡蘿卜