磁性殼聚糖微球固定化酶酶解芝麻餅粕蛋白制備ACE抑制肽的研究.pdf

1、本文以固定酶酶解芝麻餅粕蛋白制備ACE抑制肽為研究課題，對(duì)酶解芝麻餅粕蛋白常用蛋白酶進(jìn)行了篩選，通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了制備磁性殼聚糖微球固定化Alcalase堿性蛋白酶的最佳工藝，通過響應(yīng)面優(yōu)化確定固定酶酶解芝麻餅粕蛋白制備ACE抑制肽的最佳酶解條件，最后采用超濾和葡聚糖凝膠層析對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行分離純化。
　　以自制芝麻餅粕蛋白為底物，以水解度和短肽生成率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在各種酶推薦的最適酶解條件下比較Alcalase堿性蛋白酶、菠蘿

2、蛋白酶、胰蛋白酶、2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Nuetrase中性蛋白酶六種常用蛋白酶酶解芝麻餅粕蛋白制備芝麻多肽的能力，并分析多肽的ACE抑制活性。研究發(fā)現(xiàn):在相同底物濃度和加酶量條件下，Alcalase水解產(chǎn)生的芝麻多肽產(chǎn)率最高且水解度也較高。且由Alcalase堿性蛋白酶酶解所產(chǎn)生多肽的ACE抑制活性最強(qiáng)，2.5 mg/mL的多肽溶液的ACE抑制率為（67.42±1.75）％。
　　使用自制磁性殼聚糖微球載體固定化Alc

3、alase堿性蛋白酶，考察給酶量、pH、戊二醛濃度以及交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化Alcalase堿性蛋白酶酶活和酶活回收率的影響，并研究該固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明制備磁性殼聚糖微球固定化Alcalase堿性蛋白酶的最佳條件:給酶量112000 u/g載體，pH8.5，戊二醛濃度8％，交聯(lián)時(shí)間11h，在此條件下酶活達(dá)最高86779 u/g，酶活回收率達(dá)77.48％。該固定酶和游離酶的最適pH分別為11和10.5，最適溫度皆為60℃，且

4、酶經(jīng)固定后pH和溫度穩(wěn)定性都明顯高于游離酶;重復(fù)使用固定酶5次后酶活保持80.89％;比較固定酶和游離酶米氏常數(shù)可知，固定酶具有更強(qiáng)的底物親和力;透射電鏡顯示Fe3O4磁核和磁性殼聚糖微球皆為表面光滑球形的納米級(jí)粒子，高比表面積能提供更多酶結(jié)合位點(diǎn);通過紅外光譜分析正明Fe3O4已被殼聚糖包埋，經(jīng)振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)所制得固定化酶具有良好磁響應(yīng)性。
　　使用磁性殼聚糖微球固定化Alcalase堿性蛋白酶酶解芝麻餅粕蛋白

5、，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合后得到有效數(shù)學(xué)模型，并通過計(jì)算得到最佳工藝條件:加酶量7105.03 u/g蛋白、溫度59℃、pH10.96、酶解時(shí)間4.3 h，此時(shí)短肽生成率和ACE抑制率分別為86.35％和65.5％。
　　最后通過超濾和葡聚糖G-15凝膠層析對(duì)制得的ACE抑制肽進(jìn)行進(jìn)一步純化。通過5KD超濾膜超濾后短肽含量達(dá)73.85％，較超濾前略有提高。采用