腸結核與克羅恩病腸粘膜組織中膠原纖維及相關蛋白表達研究.pdf

1、腸結核（intestinal tuberculosis，ITB）是由結核分支桿菌感染引起的腸道特異性感染性疾病，是最常見的肺外結核之一，主要因感染人型結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起，少數(shù)因進食未經消毒的乳制品或牛奶而感染牛型結核分支桿菌（Mycobacterium bovis）引起;克羅恩病(crohn's disease，CD)是一種病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發(fā)生可能是遺傳與

2、環(huán)境共同作用的結果，可以累及從口腔至肛門整個消化道任何部位。腸結核與克羅恩病是兩種病因完全不同的疾病，但均可導致腸道慢性肉芽腫性改變，兩病在臨床表現(xiàn)、內鏡特點，組織病理學特征等方面十分相似。由于病因、治療方案及預后截然不同，當兩病發(fā)生誤診時將會導致嚴重后果[5,6]。當腸結核被誤診為克羅恩病時使用免疫抑制劑治療將引起結核擴散，甚至危及患者生命;而當克羅恩病被誤診為腸結核時使患者承受不必要的抗結核治療藥物的毒副作用，同時延誤原發(fā)病的治療可

3、能引起原可以避免的并發(fā)癥發(fā)生。因此，準確鑒別腸結核與克羅恩病十分必要。
　　正常情況下，組織損傷后有再生和纖維性修復兩種方式，兩種過程保持動態(tài)平衡，維持著腸道正常的結構和功能。腸結核與克羅恩病均引起腸道長期慢性炎癥，目前推測，腸道長期慢性炎癥刺激導致腸道組織損傷，釋放大量炎性介質，刺激成纖維細胞等活化并在損傷部位聚集，細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)合成增多，降解減少，過量細胞外基質的沉積可導致腸道纖維

4、化的形成[7，8]。因此，腸道纖維化在腸結核與克羅恩病中均起著重要作用。
　　在眾多參與纖維化形成的蛋白中，轉化生長因子β(TGF-β)是目前公認的最重要的致纖維化細胞因子，在腸道纖維化過程中起重要作用[9,10]。在克羅恩病狹窄腸段中TGF-β表達明顯增高，并與成人克羅恩病引起早期腸道切除術相關[11]。目前有不少研究探討克羅恩病中腸道纖維化形成的機制。相關研究提示克羅恩病相關的腸道纖維化可能與上皮間質轉化(epithelial

5、-mesenchymal transition，EMT)相關，表現(xiàn)為上皮細胞標志物表達減少，間質細胞標志物(如波形蛋白，vimentin)表達增加[12,13]。
　　因此，本研究擬通過比較腸結核與克羅恩病腸鏡活檢粘膜組織中總膠原纖維、Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積量及纖維化相關蛋白TGF-β、vimentin表達差異，探索這些指標在鑒別腸結核與克羅恩病中的價值，尋找鑒別兩病的新方法。
　　目的：
　　通過分析腸結核與克羅恩病患者

6、腸鏡活檢標本膠原纖維及纖維化相關蛋白轉化生長因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)在兩者間表達水平差異，探索其在鑒別兩病中的價值，尋找鑒別兩種疾病的新方法。
　　方法：
　　收集2006年1月至2015年6月在南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院確診為腸結核、克羅恩病患者的腸鏡活檢標本，同時收集健康體檢者的回盲部組織作為正常對照組，其中腸結核組15例，克羅恩病組19例，正常對照組15例。每例病理組織連續(xù)切片4張，分別行masso

7、n染色、免疫熒光雙染色、免疫組化染色。采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)分析圖片，計算累積吸光度(Integral opticaldensity，IOD)，以IOD反應各指標表達水平，比較各指標在三組間表達差異，并采用受試者工作曲線（Receiver Operator Curve，ROC曲線）評價這些指標對鑒別兩病的價值。所得數(shù)據均使用SPSS19.0軟件分析，P小于0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：

8、
　　腸結核組、克羅恩病組臨床表現(xiàn)、內鏡下及病理學特征比較腸結核組與克羅恩病組臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥比較:在臨床表現(xiàn)方面，腹痛、腹瀉、體重下降在克羅恩病組較腸結核組多見，而發(fā)熱、血便在腸結核組較克羅恩病組多見，但這些癥狀在兩組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）;腸結核組合并腸外結核較克羅恩病組多，且差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.028)，克羅恩病組合并腸腔狹窄、腸梗阻、瘺管形成均較腸結核多，但兩者比較差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞

9、0.05）。腸結核組與克羅恩病組內鏡下表現(xiàn)及病理組織學特征比較:在內鏡下表現(xiàn)方面，假性息肉及鵝卵石征在克羅恩病中更常見，顯著高于腸結核組(P＜0.05)，腸粘膜充血、糜爛、潰瘍形成、縱行潰瘍及粘膜橋形成在克羅恩病組中較腸結核組中多見，而回盲瓣受累、環(huán)形潰瘍在腸結核組中較克羅恩病組中更常見，但這些指標在兩病間差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。
　　Masson染色檢測總膠原纖維在各組間表達通過masson染色法觀察膠原纖維在各

10、組間表達，在Masson染色中，膠原纖維呈藍色信號。正常腸道組織中可觀察到少量膠原纖維均勻分布于腸道各層中，腸結核組及克羅恩病組膠原纖維表達顯著增高，交錯排列于腸道各層中。各組間膠原纖維含量比較:(1)三組間總膠原纖維含量（正常組:6964.20±819.98;腸結核組:22093.53±1643.12;克羅恩病組:15200.42±1232.63）比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);(2)組間比較:a.在腸結核組與克羅恩病組中，纖

11、維沉積量顯著增高，總膠原纖維定量均顯著高于正常對照組（P正常組vs ITB組=0.000; PCD組vs正常組=0.000）;b.腸結核組與克羅恩病組比較，腸結核組總膠原沉積量顯著高于克羅恩病組(P=0.007);表明腸結核與克羅恩病均可引起腸道不同程度纖維沉積，且以腸結核引起腸道纖維沉積更顯著。
　　免疫組化檢測TGF-β、vimentin在各組間表達光鏡下可見轉化生長因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)陽性信號呈

12、棕黃色顆粒，TGF-β在腺上皮及間質細胞中均有表達，vimentin主要在間質細胞中表達。各組間TGF-3表達強度比較:(1)三組中TGF-β表達強度在腸結核組最高（70327.80±15523.75），其次為克羅恩病組（67823.21±6302.86），正常對照組最低（21871.33±3229.77），三組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)組間比較:a.腸結核組與克羅恩病組TGF-β表達強度顯著高于正常組(PCD組v

13、s正常組=0.000，PITB組vs正常組=0.023);b.腸結核組與克羅恩病組TGF-β表達強度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.998)。各組間vimentin表達強度比較:(1)三組中vimentin表達強度在克羅恩病組最高（96885.84±7073.05），腸結核組次之（63583.40±10741.80），正常組最低（30959.80±3650.68），三組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)組間比較:a.腸結核

14、組與克羅恩病組vimentin表達顯著高于正常組（PCD組vs正常組=0.000，PITB組vs正常組=0.030）;b.與腸結核組比較，克羅恩病組vimentin表達顯著增高(P=0.046)。
　　ROC曲線分析各指標對鑒別腸結核與克羅恩病的價值以上實驗結果表明，腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量、纖維化相關蛋白vimentin表達水平在腸結核組與克羅恩病組間存在統(tǒng)計學差異。通過ROC曲線評價以上四項指標對兩種疾病

15、的鑒別診斷價值。曲線下面積（Areaunderthe curve，AUC）反映診斷實驗的準確性，當曲線下面積小于0.5時無診斷價值，曲線下面積在0.5-0.7時診斷準確性較低，在0.7-0.9時診斷準確性較高，在0.9以上時診斷準確性最高。ROC曲線分析結果顯示，腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量對腸結核與克羅恩病有一定的鑒別診斷價值。以腸結核為陽性事件，總膠原纖維定量ROC曲線下面積為0.807(P=0.002，95％CI

16、0.661-0.953)，其在截斷值為16937處診斷指數(shù)最大，對鑒別兩病的靈敏度為80.0％，特異度為78.9％，陽性預測值為75.0％，陰性預測值為83.3％;Ⅰ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.751(P=0.013，95％CI0.589-0.913)，其在截斷值為4392處診斷指數(shù)最大，對診斷兩病的靈敏度為86.7％，特異度為52.6％，陽性預測值為59.1％，陰性預測值為83.3％;Ⅲ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.814(P=

17、0.002，95％CI0.672-0.956)，其在截斷值11771處診斷指數(shù)最大，對鑒別兩病的靈敏度為73.3％，特異度為73.7％，陽性預測值為68.8％，陰性預測值為77.8％。而vimentin表達強度的ROC曲線下面積為0.235(P=0.009，95％ CI0.059-0.411)，對鑒別兩病價值不大。
　　結論：
　　腸結核與克羅恩病在臨床特征、腸鏡及病理表現(xiàn)非常相似，臨床難以鑒別。兩病均可引起腸道不同程度纖維