兩株地下海水微藻的分子鑒定和金藻乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達(dá).pdf

1、目前,微藻因其具有重要價(jià)值的代謝產(chǎn)物而引來世界各國(guó)的高度關(guān)注,主要體現(xiàn)在其所含豐富的脂肪酸成份,同時(shí),其豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物在人體健康營(yíng)養(yǎng)方面具有重要的意義。
　　本研究主要是對(duì)分離自距我國(guó)山東省東營(yíng)廣饒縣小碼頭44.08km的渤海沿岸地下海水兩株微藻進(jìn)行分子鑒定及其油脂分析;在基因工程水平,對(duì)金藻中具有生物活性和食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的萜類化合物的代謝調(diào)控開展初步研究。
　　1、利用18S rDNA和ITS主要分子指標(biāo),結(jié)合序列比對(duì)和

2、系統(tǒng)發(fā)育樹分析,對(duì)兩株微藻進(jìn)行分子鑒定、總脂提取以及脂肪酸各組分測(cè)定。研究主要結(jié)果如下:
　?、偻ㄟ^設(shè)計(jì)特定引物對(duì)兩株微藻的18S rDNA和ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增,獲得序列經(jīng)過NCBI軟件比對(duì),建立系統(tǒng)發(fā)育樹分析,鑒定結(jié)果:D12 Strain為鹽生微擬球藻(N.salina D12,登錄號(hào):JX185299);而另一株D2 Strain為尋常小球藻(C.vulgaris D2,登錄號(hào):JX185298)。
　?、讷@得培養(yǎng)至平

3、臺(tái)期的N.salina D12和C.vulgaris D2油脂含量分別為44％和35%。
　?、圻x擇K(OH)-CH3OH作為皂化試劑提取脂肪酸,利用氣相色譜法分析,結(jié)果顯示:N.salina D12中,脂肪酸成分主要為C16:0,C16:1和C18:1,占總脂肪酸含量約80%,C20以上的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸約15%,其中EPA約10%。C.vulgaris D2中,脂肪酸以C16:0,C18:1和C18:2為主,占總脂肪酸含量9

4、0%,不含C20以上的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
　　2、ACAT是合成類異戊二烯天然物質(zhì)(MVA途徑)的第一個(gè)酶。本研究根據(jù)金藻(Isochrysis galbana CCMM5001)文庫(kù)中ACAT的EST序列,克隆獲得IgACAT(Isochrysis galbana ACAT)基因cDNA全長(zhǎng)序列及對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析;應(yīng)用RT-qPCR,以β-actin為內(nèi)參基因,研究了IgACAT基因在不同濃度硝酸鈉(mg/L)和不同溫度

5、(℃)條件下的表達(dá)差異。結(jié)果表明:
　?、僖蕴崛〉慕鹪蹇俁NA為模板,利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)成功克隆了IgACAT(GeneBank accession number:JQ310661),并對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析,IgACAT全長(zhǎng)1,551bp,包括69bp的5′UTR和309bp的3′UTR;ORF長(zhǎng)1,173bp,編碼390個(gè)氨基酸,Mw為53.59kD,PI

6、為9.04;進(jìn)化樹分析顯示IgACAT與MVA途徑中的ACAT聚為一類,而與β氧化途徑中的KAT完全分開;同源性比對(duì)結(jié)果,與巴西橡膠樹(Heve-bra,AAl18924),煙草(Nico-tab,AAU95618),玉米(Zea-may,ACG34735),鞘脂桿菌屬(Mari-tra,YP_004053305),噬冷菌(Algo-sp,ZP_07721232),園桿菌(Bell-bal,YP_006408471),黃質(zhì)菌屬(Flav

7、-sp,ZP_10483595),解肝磷脂土地桿菌(Pedo-hep,YP_003093161),加拿大鞘脂桿菌(Soli-can,YP_006255711),蘿卜(Raph-sat,X78116)這些真核、原核生物體的ACAT基因的氨基酸序列高度同源,且有一非常保守的功能域(CNGGGGA)。
　　并推測(cè)此基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì),具有兩個(gè)跨膜區(qū)域(第46-64位和第365-386位)。
　?、谠诘^量(150mg/L Na

8、3NO3)條件下,IgACAT基因在72h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,為初始0h(對(duì)照)的約10.1倍;在氮正常(75mg/L Na3NO3)條件下,其在24h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高,為對(duì)照的6倍,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),呈下降趨勢(shì);在氮缺乏(0mg/L Na3NO3)條件下,IgACAT基因表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都普遍偏低,且總體趨勢(shì)無明顯變化,與對(duì)照表達(dá)水平相當(dāng)。
　?、墼诟邷叵屡囵B(yǎng)(35℃),IgACAT基因的表達(dá)量先急劇增加,在12h表達(dá)量達(dá)到最