腺病毒介導的人精脒-精胺N1乙?；D(zhuǎn)移酶表達對胃癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、胃癌在全世界很多國家的發(fā)病率都很高。在日本,胃癌仍舊是男性最常見的腫瘤。
　　 多胺是腐胺、精脒和精胺的統(tǒng)稱,是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的陽離子脂肪族化合物,這些陽離子電荷使得多胺可通過靜電作用與細胞內(nèi)的含有多聚陰離子的大分子化合物如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng),在正常細胞生長和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。在迅速增殖的正常細胞以及腫瘤細胞中,多胺的含量明顯升高。以多胺代謝通路為靶點,降低細胞內(nèi)多胺水平,在腫瘤治療研究中具有非常

2、重要的意義。
　　 多胺合成途徑有兩個關(guān)鍵酶,即鳥氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶。它們一直是研究的重點。與相應(yīng)的正常組織相比,在結(jié)腸癌組織中ODC和AdeMetDC的表達明顯升高,而且通過抑制它們的表達可以下調(diào)多胺的合成,從而抑制腫瘤生長。
　　 精脒/精胺N1乙?；D(zhuǎn)移酶,是多胺分解途徑中的第一個限速酶。SSAT將乙酰-CoA上的乙酰基團轉(zhuǎn)移到精脒和精胺的N1位置上。SSAT可以防止多胺在細胞內(nèi)過高積聚,在保持細胞

3、內(nèi)多胺的平衡中起到重要作用。SSAT的活性可以被胞內(nèi)的多胺水平高度誘導和調(diào)節(jié),從而維持細胞內(nèi)的多胺平衡。另外,SSAT可以被多種生長抑制劑及各種有毒刺激誘導產(chǎn)生。SSAT的蛋白水平和酶活性在正常和沒有被誘導的細胞中是一般測不到的。而在多胺擬似物的誘導下,活性可以增加1000倍以上。Kristin Kee和Slavoljub Vujcic等人研究發(fā)現(xiàn)在SSAT水平上促進多胺降解能更有效的降低細胞內(nèi)多胺水平。
　　 端粒酶是目前所發(fā)

4、現(xiàn)的惡性腫瘤最廣譜的分子標記,可以在90％的惡性腫瘤中被激活,而其在正常體細胞中一般為陰性表達。人端粒酶的主要成分有人端粒酶RNA、人端粒酶相關(guān)蛋白、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。人類端粒酶是一種維持端粒長度的一種逆轉(zhuǎn)錄酶,hTERT的表達幾乎只限制在腫瘤細胞中,并與端粒酶活性密切相關(guān)。而端粒酶的其他組分在正常腫瘤細胞中均表達。因此,我們選擇胃癌為目標,以SSAT為靶點,利用hTERT啟動子只在腫瘤細胞中表達,而在正常細胞中不表達的特點,構(gòu)建了一種

5、由hTERT啟動子介導的、表達SSAT的重組腺病毒載體。我們利用該表達載體系統(tǒng)在體外研究了SSAT表達增高對胃癌細胞生長的抑制作用,并建立了裸鼠皮下胃癌移植瘤模型,在體內(nèi)對SSAT表達增高抑制胃癌的作用進行了研究。
　　 第一部分腺病毒介導的SSAT表達抑制胃癌細胞增殖的體外研究實驗?zāi)康?構(gòu)建hTERT啟動子介導的人SSAT表達的腺病毒載體,研究重組腺病毒Ad-SSAT對胃癌細胞多胺合成的作用,觀察對細胞增殖的抑制作用。

6、　　 實驗方法:
　　 1.采用RT-PCR方法克隆人SSAT mRNA翻譯區(qū)的基因片斷；將其插入pMD-18T載體中,經(jīng)NcoⅠ、XbaⅠ酶切回收,插入到質(zhì)粒pGL3-hTERT中,然后將重組的pGL3-hTERT-SSAT用SalⅠ和HindⅢ雙酶切回收,插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack形成重組質(zhì)粒pAdTrack-hTERI-SSAT。重組質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切線性化后,轉(zhuǎn)入Adeasy-1細菌與pAdeasy-1質(zhì)粒發(fā)生同源重

7、組。將重組質(zhì)粒pAdeasy-hTERT-SSAT,經(jīng)PacⅠ酶切后,轉(zhuǎn)染293細胞包裝成腺病毒顆粒。
　　 2.利用熒光顯微鏡和PCR的方法對重組腺病毒Ad-hTERT-SSAT進行鑒定。
　　 3.根據(jù)參考文獻報道設(shè)計SSAT基因的siRNA片段,表達載體pGPU6/GFP/Neo-shSSAT的合成與構(gòu)建由上海吉瑪公司完成。
　　 4.采用MTS法測定不同MOI的腺病毒對胃癌MGC803和SGC7901細胞

8、的基因轉(zhuǎn)染效率,尋找不同細胞的最適感染滴度。
　　 5.采用Western印跡技術(shù)檢測重組腺病毒以及RNA干擾載體pGPU6/GFP/Neo-shSSAT感染或轉(zhuǎn)染胃癌細胞后SSAT蛋白表達情況,并利用高效液相(HPLC)法檢測其對胃癌細胞中多胺含量的影響。
　　 6.采用MTS法檢測重組腺病毒Ad-SSAT和RNA干擾載體pGPU6/GFP/Neo-shSSAT對胃癌MGC803和SGC7901細胞增殖的影響。并進一步

9、運用克隆形成實驗觀察各組細胞克隆形成率。
　　 7.采用流式細胞術(shù)檢測Ad-SSAT對MGC803和SGC7901細胞周期分布的影響。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.成功擴增出SSATcDNA片斷且測序正確,然后經(jīng)TA克隆連接到質(zhì)粒pGL3-hTERT和pAdTrack中,酶切及測序驗證基因插入方向和序列都正確。在轉(zhuǎn)入Adeasy-1細菌后獲得多個陽性重組克隆。重組質(zhì)粒pAdeasy-hTERT-SSAT轉(zhuǎn)染293

10、細胞進行包裝擴增,熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白在293細胞中表達,并且PCR證實基因組中含有目的基因。
　　 2.成功合成沉默SSAT的RNAi載體pGPU6/GFP/Neo-shSSAT。
　　 3.腺病毒對胃癌細胞MGC803和SGC7901的最適MOI分別是50和25。分別以該MOI的Ad-SSAT感染MGC803和SGC7901細胞可明顯抑制其生長增殖,最大抑制率分別為65％和55％,但不會引起細胞毒性作用。

11、r>　　 4.Ad-SSAT感染MGC803和SGC7901細胞,可明顯增強SSAT基因表達,兩種細胞SSAT表達分別為對照組的265％和210％;而RNA干擾沉默SSAT表達可明顯抑制兩株細胞中SSAT的表達,其抑制率分別為85％和73％。HPLC結(jié)果顯示,MGC803和SGC7901細胞感染Ad-SSAT后細胞內(nèi)精胺和精脒含量明顯降低,而RNAi沉默SSAT表達后細胞內(nèi)精胺和精脒含量明顯升高。
　　 5.細胞生長曲線顯示A

12、d-SSAT感染MGC803和SGC7901細胞,可以明顯抑制細胞的增殖,而RNAi沉默SSAT表達則使細胞增殖加快。細胞克隆形成實驗進一步驗證了這個觀點。
　　 6.流式細胞DNA含量分析顯示,Ad-SSAT可引起MGC803和SGC7901細胞周期S期阻滯,但并未引發(fā)凋亡。
　　 實驗結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建SSAT腺病毒表達載體以及SSAT RNA干擾表達載體,為進一步研究SSAT作為胃癌的基因治療和預(yù)防研究

13、提供了必要的工具。Ad-SSAT可顯著上調(diào)胃癌細胞中SSAT的表達,使細胞周期阻滯于S期,抑制細胞增殖,提示其有抑胃癌作用。
　　 第二部分腺病毒介導的SSAT表達引起胃癌細胞周期阻滯于S期的分子機理研究
　　 實驗?zāi)康?觀察Ad-SSAT對S期主要的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控作用,研究Ad-SSAT引起胃癌細胞周期阻滯于S期的分子機制。
　　 實驗方法:
　　 1.Western blotting檢測Ad-

14、SSAT對細胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin A和Cdk2蛋白水平的影響作用。
　　 2.半定量RT-PCR法檢測Ad-SSAT對細胞內(nèi)cyclin A和Cdk2的mRNA水平的影響作用。
　　 3.采用Western blotting和RT-PCR法檢測Ad-SSAT對核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1表達的影響。
　　 4.雙熒光素酶活性測定檢測Ad-SSAT對E2F啟動子活性的影響。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1

15、.Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,Ad-SSAT感染分別使MGC803和SGC7901細胞中cyclin A蛋白表達下調(diào)80％和60％左右,但Cdk2蛋白的表達無明顯變化。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示,Ad-SSAT處理組MGC803細胞cyclinA mRNA表達水平降低了80％,SGC7901細胞cyclinA mRNA表達水平降低了70％。而三組中的Cdk2mRNA沒有明顯變化。
　　 3.We

16、stern blotting和RT-PCR結(jié)果顯示Ad-SSAT抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達,E2F1蛋白表達下調(diào)70％和60％左右,E2目的mRNA也分別有90％,60％的降低。
　　 4.雙熒光素酶活性測定結(jié)果顯示Ad-SSAT可抑制E2F啟動子活性,使其活性下調(diào)60％以上。
　　 實驗結(jié)論:
　　 Ad-SSAT抑制S期主要的細胞周期蛋白cyclin A的轉(zhuǎn)錄和翻譯,同時抑制其上游核轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表

17、達,并且抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動子的活性。提示Ad-SSAT可能是通過下調(diào)E2F啟動子活性,抑制其基因表達,從而下調(diào)下游S期主要細胞周期蛋白cyclin A的表達,引起細胞周期阻滯,起到抑制細胞增殖的作用。
　　 第三部分 Ad-SSAT對胃癌細胞生長抑制作用的體內(nèi)研究
　　 實驗?zāi)康?通過裸鼠皮下胃癌移植瘤試驗,觀察腺病毒Ad-SSAT介導的SSAT基因上調(diào)對胃癌的抑制作用。
　　 實驗方法:
　　 1

18、.移植瘤模型的建立:將SGC7901,SGC7901/GFP和SGC7901/Ad-SSAT細胞分別接種在4周齡的裸鼠皮下。
　　 2.移植瘤及裸鼠的監(jiān)測:從注射后的第八天開始,每隔4天測量腫瘤大小,制備各組裸鼠腫瘤的生長曲線,并稱取裸鼠體重,觀察動物的一般狀況。接種后33天處死裸鼠,稱取腫瘤重量。
　　 實驗結(jié)果:
　　 裸鼠皮下胃癌移植瘤模型顯示SGC7901/Ad-SSAT組裸鼠的腫瘤出現(xiàn)較晚,生長速度明顯