葛根糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、葛根是一種藥用植物，根部可作為藥材，具有很高的藥用價(jià)值，廣泛用于治療心腦血管疾病、糖尿病、肝病等疾病。葛根中的主要活性物質(zhì)為葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物，該類化合物具有具有抗炎、抗癌、抗氧化等特性。
　　糖基轉(zhuǎn)移酶UGT(glycosyltransferases)能將UDP活化的糖分子轉(zhuǎn)移到生物大分子上，是自然界最重要的修飾基因之一。異黃酮類化合物是植物中分布最廣泛的此生代謝產(chǎn)物之一。在葛根中，UGT對黃酮類化合物進(jìn)行糖基化修飾

2、，合成異黃酮糖苷，在黃酮的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲等方面發(fā)揮了重要的作用。葛根素結(jié)構(gòu)的特殊性在于葡糖糖基以C-C鍵與母環(huán)相連，而絕大多數(shù)異黃酮糖苷都以C-O鍵與甘元母環(huán)相連。葛根中存在2類對應(yīng)的UGT，即碳苷糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT)和氧苷糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)。
　　為了挖掘葛根中的UGT基因，本課題通過轉(zhuǎn)錄組測序找到了140多個UGT基因序列。通過與已知CGT和OGT進(jìn)行序列比對分析，選定8個目標(biāo)基因，分別命名為GT1、GT2、GT3、GT4

3、、GT5、GT6、GT7、GT8，成功克隆基因，并通過蛋白原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)根誘導(dǎo)技術(shù)初步驗(yàn)證基因功能。
　　將目標(biāo)基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，將載體轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株Rosetta(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)?；騁T1、GT2、GT3、GT4、GT5、GT7、GT8均成功誘導(dǎo)出目標(biāo)蛋白(51KD左右)，用超聲破碎法提取蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白大部分出現(xiàn)在沉淀中，上清液中含量極少。在配好的反應(yīng)體系中加入提取的GT蛋白上清液，發(fā)現(xiàn)G

4、T4具有很強(qiáng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠催化大豆甘元、染料木素、芒柄花素、黃豆黃素合成對應(yīng)的7-O-葡糖糖苷，且轉(zhuǎn)化率很高，接近完全轉(zhuǎn)化;GT4對甘草素和異甘草素?zé)o反應(yīng)。由此說明GT4是特異性識別異黃酮并高效催化其合成7-O-葡萄糖苷的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。此外，發(fā)現(xiàn)GT1可催化芒柄花素合成芒柄花苷，但是活性很低。其他GT基因無糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
　　將目標(biāo)基因構(gòu)建到超表達(dá)載體pB7WG2D，轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599并侵染大豆子葉，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因發(fā)根